烟草丛顶病毒ORF3的功能分析
免疫胶体金标记的原理是病毒经兔抗血清修饰处理，再用结合有胶体金颗粒的羊抗兔IgG标记，以吸附于病毒周围的金颗粒为指示物，鉴别病毒与抗血清的反应（陈剑平等，1993）。
本文利用已制备保存的TBTV ORF3及ORF4多克隆兔抗血清及结合胶体金标记的羊抗兔IgG检测TBTV发病烟草超薄切片，通过金颗粒在TBTV发病烟草细胞中的位置，完成TBTV ORF3及ORF4的细胞定位。
1.5.2 烟草丛顶病毒ORF3基因功能研究的意义
幽影病毒与其它植物病毒的不同之处在于，这类病毒的基因组不含编码外壳蛋白(coat protein，CP)的基因，在感病植株体内不形成病毒粒体结构。自然条件下，幽影病毒感染的植物体内常常发现有黄症病毒复合侵染，幽影病毒必须依靠黄症病毒进行蚜虫传播。幽影病毒属病毒目前在我国仅有TBTV方面的报道，由TBTV和TVDV复合侵染引起的烟草丛顶病也是目前国内报道的唯一一个由幽影病毒属成员引起的病害（李凡，2006）。
近年来，烟草丛顶病在我国云南局部地区的流行危害，给当地经济发展造成了严重损失。但由于其病原物——烟草丛顶病毒无编码外壳的基因特殊性，国外仅限于其症状学、传播途径和病原物寄主范围的描述，而对分子生物学研究尚未开展；自21世纪以来国内对烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒分子生物学的研究，已取得了很大的进展，已获得TBTV全长基因组。但TBTV 各个ORF的功能为见研究报道，对TBTV各个ORF的功能进行分析，探明TBTV的各个ORF功能及病毒在寄主体内增殖、移动以及致病的分子机理，可为TBTV的深入研究及其病害防治提供基础分子生物学依据。
虽然目前基因功能研究已成为热点，但仍存在很多困难。据幽影病毒属病毒间的序列分析及比较，推测TBTV ORF3编码蛋白具有CP基因辅助病毒粒子完成长距离运输的功能，开展对TBTV ORF3基因功能的分析，有利于明确TBTV在寄主植物体内的扩散机制，这对阻断病毒在侵染寄主后的扩散及防治能提供理论基础；对TBTV其他ORF的功能分析能提供良好的依据。
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2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 病毒来源
烟草丛顶病样品采自云南省保山市龙陵县，由云南省烟草科学研究所的莫笑晗副研究员馈赠，通过介体蚜虫取食发病烟叶获毒后，取食健康烟叶将烟草丛顶病毒传代保存于云南农业大学温室内。
2.1.2 抗血清
TBTV ORF3及TBTV ORF4抗血清由龙亚芹制备保存。
2.1.3 植物材料
本氏烟，转GFP本氏烟由华南农业大学李华平老师馈赠。
2.1.4 菌种及载体
Escherichia Coli DH5ａ菌株为本实验室保存；GV3101(pJIC Sa-rep)由浙江大学周雪平教授惠赠；pMD18-T载体购自大连宝生物生物工程公司；pGR107载体、pGR208载体由华南农业大学李华平教授馈赠；BL21（pET28a-ORF3）菌株由本实验室龙亚芹提供。
图2-1 pMD18-T克隆载体图谱及多克隆位点序列 Fig.2-1 Map and multiple cloning sequence of pMD18-T vector
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MCS: Smal I
ATCGATT CCCGGG TCGACCGC CGATAAG Cal I SalＩ
图2-2 pGR107双元载体图谱及多克隆位点序列 Fig2-2 Map and multiple cloning sequence of pGR107 vector
2.1 方法
pGR107-ORF3载体构建技术路线： 提取烟草丛顶病染病烟株总RNA及RT-PCR扩增ORF3序列 连接 pGR107-ORF3 25
根据TBTV全序列及pGR107载体设计带酶切位点Sal I/Spel I的ORF3特异引物 ORF3序列插入克隆载体pMD18-T pMD18-ORF3的克隆及测序 Sal I/Spe I酶切 pGR107载体 ORF3 pGR107载体 烟草丛顶病毒ORF3的功能分析
pGR107-GFP及pGR107-GFP-ORF3载体构建技术路线： pGR107-GFP pGR107-GFP-ORF3 pGR107 连接 gfp 连接 pGR107-ORF3 Cal I/Sal I酶切 pGR107 pMD18-GFP的克隆及测序 pGR107-ORF3 gfp基因序列插入克隆载体pMD18-T 从pGR208载体上PCR扩增gfp基因 根据pGR208及pGR107载体设计带酶切位点Cal I/Sal I的gfp特异引物 2.2.1 烟草丛顶病毒ORF3基因的克隆及测序 2.2.1.1 烟草丛顶病毒ORF3引物设计和合成
根据Mo所登录（Mo et al，2003）的TBTV基因组全序列（AF402620）及pGR107载体cp基因两端的酶切位点Sal I/Spe I，设计TBTV ORF3带有酶切位点Sal I/Spe I的特异引物对PTB3F/ PTB3R（由上海生工合成），该引物扩增的目的条带为714bp。引物序列如下：
PTB3F：ACGCGTCGACATGTCTACGATCATAAATGT PTB3R：GACTAGTTCACCACTTGTTGGTGGT 2.2.1.2 烟草丛顶病病叶总RNA的提取（MRCgene公司的Tri Reagent）
称取50-100mg病叶加入1mL Trizol充分研磨，转入1.5mL离心管中静止
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3-5min；加入200μL氯仿，充分混匀后静止2-3min，12,000rpm离心5min后取上清；加入0.5mL异丙醇，室温放置10min，12,000rpm离心15min后弃上清；70%乙醇洗涤沉淀，自然干燥，用20-25μLDEPC处理的ddH2O充分悬浮，-20℃保存备用。
2.2.1.3 RT(cDNA合成)（20μL反应体系）（Promega 公司的M-MLV Reverse Transcriptase）
PCR管（所用试剂器皿均需作无RNA酶处理）中加入2μL RNA模板，1μL PTB3R(引物浓度20um)，10.375μL DEPC水。于70℃水浴5min，然后迅速置于冰上。在加入3μL M-MLV 5×Reaction Buffer，5μL dNTP（10mM），0.625μL Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor，1μL M-MLVRT。42℃，60min取出后放在冰上，或-20℃备用。
2.2.1.4 PCR（25μL反应体系）（TaKaRa公司rTaq DNA聚合酶）
在PCR管中加入2μL 10×Buffer，0.5μL dNTP Mixture，0.5μL cDNA，0.5μL PTB3F，0.5μL PTB3R，20.25μL ddH20，0.25μL Taqmes，混匀。PCR管置于PCR仪中，设定循环体系，预变性94℃ 4min，变性94℃ 1min，退火55℃ 1min，延伸72℃ 2min，终延伸72℃ 10min，30个循环。反应结束后取5μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。其余样品-20℃保存备用。
2.2.1.5 PCR产物割胶回收（Axygen公司割胶回收试剂盒）
在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体并切碎、计算凝胶的重量（提前记录1.5mL离心管重量），该重量做为一个凝胶体积（100mg=100μL体积）；加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后75℃加热，间断混合，直至凝胶块完全熔化；加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B混合均匀；吸取混合液，转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min弃滤液；将制备管放回离心管加入0.5mL Buffer W1，12000rpm离心30s，弃滤液；将制备管置回离心管，加入0.7mL Buffer W2，12000rpm离心30s，弃滤液再重复此操作一次；制备管置于2mL离心管中，12000rpm离心1min；制备管置于洁净1.5mL离心管中，在DNA制备膜正中央加25-30μL水或Eluent，室温静置1min，12000rpm离心1min洗脱DNA。
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