烟草丛顶病毒ORF3的功能分析
2.2.1.6 克隆载体pMD18-T与扩增片段ORF3连接（TaKaRa公司的T4连接酶）
利用pMD18-T载体进行T/A连接，构建重组质粒。电泳确定回收产物的纯度和浓度后，按 TaKaRa公司的操作说明，其连接体系为10μL，在20μL PCR管中加入4μL回收纯化DNA，1μL pMD18-T载体，5μL Ligation solution I混和均匀后，16 ℃水浴4h。
2.2.1.7 大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备（萨姆布鲁克等，2002）
接种-80℃长期保存的菌株DH5α到5mL LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜(12 h左右)；按1：100稀释到新鲜的LB液体培养基中，继续37 ℃摇床培养2 h；取出菌液置冰上10 min，将冰冷的菌液1 mL管分装到1.5 mL的eppendorf管，8000 rpm离心1 min，弃上清；沉淀用200 μL预冷的0.1 mol/L CaCl2悬浮，冰浴30 min后离心，8000 rpm离心1 min，弃上清，沉淀再用100 μL 0.1 mol/L CaCl2重悬浮，冰浴放置6-8 h备用，24 h内可用转化效率逐渐减小。
2.2.1.8 转化及蓝白斑筛选（萨姆布鲁克等，2002）
将制备好的感受态细胞置于冰上；将10 μL连接产物加到100 μL感受态细胞中混匀；将混合物置于冰上30min，然后在42℃水浴热击90s，立即转移到冰上5min；加入890μL冰预冷的LB培养液（不含抗生素），混匀；37℃,120 rpm，培养1h 后4000rpm离心5min；吸取800μL上清液，将剩下的200μL涂在含含氨卞青霉素（50-100 μg/mL）的LB平板上，涂板时加入4μL IPTG( 200mg/mL)(异丙基-β-硫代半乳糖苷)和40μL X-Gal(20mg/mL) (5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷)，放置30 min；倒置培养皿，37℃培养14-18 h；根据蓝白斑筛选，初步挑选白色的单菌落，进一步鉴定。
2.2.1.9 重组质粒pMD18-ORF3提取（TIANGEN高纯度质粒小提试剂盒）
向吸附柱CP3中加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min后倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；取1-5mL过夜培养的菌液加入离心管中12000rpm离心1min，尽量吸除上清；向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL已加入RNaseA的溶液P1，使用移液器彻底悬浮细菌细胞沉淀；向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，
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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析
12000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到过滤柱CS（过滤柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀；12000rpm离心2min，小心地将离心后收集管中得到的溶液转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）；12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；想吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；向吸附柱CP3中加入700μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rmp离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；向吸附柱CP3中加入500μL漂洗液PW，12000rmp离心30-60sec，倒掉收集管中的废液；将吸附柱CP3放入收集管中，12000rmp离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除；将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-100μL洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12000rmp离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。
2.2.1.10 重组质粒pMD18-ORF3的PCR鉴定
将重组质粒DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，选择滞后重组质粒进行PCR鉴定（TaKaRa公司rTaq DNA聚合酶），利用2.2.1.3中的特异引物对待检测质粒进行PCR扩增，反应体系同2.2.1.3。
2.2.1.11 重组质粒序列测定
经PCR扩增到含目的片段质粒的菌液，送上海生工进行基因测序测定，测序引物选择通用测序引物M13F，将其余菌液15%甘油-20℃保存备用。
2.2.1.12 TBTV ORF3序列分析
将上海生工测序结果与Mo所登录（Mo et al，2003）的TBTV基因组全序列（AF402620）通过DNAMAN软件进行TBTV ORF3的核苷酸及氨基酸同源性比较及分析，确定获得的TBTV ORF3序列变异在允许范畴并保证氨基酸序列能正确翻译，进行下一步实验。
2.2.2 pGR107-ORF3载体构建
2.2.2.1 克隆载体pMD18-T-ORF3及双元载体pGR107 Sal I/Spe I酶切（反应体系20μL）（TaKaRa公司的Sal I/Spe I）
在0.2mL PCR管中加入10μL pMD18-ORF3 vector，2μL 10×H Buffer，1μL Sal
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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析
I（20U/μl），1μL Spe I（20U/μl），6μL ddH2O充分混匀。同时在另一0.2mL PCR管中加入10μL pGR107 vector，2μL 10×H Buffer，1μL Sal I（20U/μl），1μL Spe I（20U/μl），6μL ddH2O充分混匀。将两PCR管置于37℃水浴过夜，取酶切产物5μl进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。
2.2.2.2 分别割胶回收目的片段ORF3及缺失cp基因的pGR107载体（Axygen公司割胶回收试剂盒）
方法同2.2.1.5。
2.2.2.3 缺失cp基因的pGR107载体与目的片段ORF3连接
将双酶切下的ORF3及缺失cp基因的pGR107片段在T4连接酶（TaKaRa公司）的作用下连接，连接体系10μL。在0.2mL PCR管中加入1 μL缺失cp基因的pGR107 vector，5μL ORF3片段，1μL T4连接酶，1μL 10×连接酶Buffer，2μL ddH2O混合均匀后，4℃连接过夜。
2.2.2.4 农杆菌GV3101感受态细胞制备(卢圣栋，1999)
GV301接种于LB液体培养基中（Rifr 50μg/mL），28℃过夜振荡；取0.2mL活化的菌液接种于10 mL含Rifr的LB液体培养基中，OD600为0.4-0.5左右，振荡6-8h；将菌液冰浴30min后，转至2mL离心管中，4℃，5000rpm离心10min。弃上清，用1mL 0.1moL/L的预冷CaCl2重悬沉淀。按每管200μL分装，放置（12-24h）后（4℃）备用效果更好；若感受态细胞暂时不用可加入灭菌甘油至15%-30%（v/v）混匀液氮速冻后于-70℃保存。
2.2.2.5 冻融法转化农杆菌(卢圣栋，1999)
取20 μL中间载体DNA加入到200 μL感受态细胞中，轻混，冰浴30min；液氮中速冻5min，37℃水浴5min，再迅速冰浴2min；加入800μL LB液体培养基（不加Rifr），28℃轻摇4-6h；取80μL-100μL菌液涂布于LB（加X-gal, IPTG）(Rifr 50μg/ mL)选择平板上，28℃倒置培养12-18h；将白斑挑单菌落于液体LB (Rif
r
50μg/ mL,Kanr 50μg/ mL)中扩繁，挑选1-2个蓝斑作对照。
2.2.2.6 pGR107-ORF3质粒提取
方法同2.2.1.9。1%琼脂糖检测质粒大小，选择滞后质粒做下一步检测。
2.2.2.7 PCR检测pGR107-ORF3质粒目的片段
为确保构建的重组载体pGR107-ORF3含有pGR107载体上的CaMV35S及TBTV ORF3基因而不含有pGR107载体上CP基因，充分证明pGR107载体上
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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析
CP基因被TBTV ORF3基因替代，PCR检测了重组载体pGR107-ORF3及原始载体pGR107上的CaMV35S、TBTV ORF3、CP基因，所用引物表2-1所示。引物设计根据pGR107载体上序列CaMV35S、CP序列设计，TBTV ORF3检测引物同上。
表2-1检测pGR107-ORF3质粒的引物 Table2-1 Detection primers for pGR107-ORF3 vector 引物名称及引物序列 Primer name and primer sequence
Tm值 Tm values
扩增片段长度 Long of amplified products
CaMV35SF：CTCGCATGCCTGCAGGTC CaMV35SR：TCCTCTCCA AATGAAATGAACT PTB3F：ACGCGTCGACATGTCTACGATCATAAATGT PTB3R：GACTAGTTCACCACTTGTTGGTGGT CPF：CACCAGCTAGCACAACACA CPR：GCCAGTCTAGCTCTGCTG
PCR检测体系同2.2.1.4。检测与目的片段大小相同的质粒的菌株GV3101(pGR107-ORF3) 大量扩繁并将部分菌液-80℃保存备用。
60℃
334bp
55℃
714bp
60℃
436bp
2.2.2.8 含重组质粒pGR107-ORF3农杆菌GV3101注射接种本氏烟
用注射器吸取1.5mL GV3101(pGR107-ORF3)菌液，挤压入本氏烟叶片上，同时设置接种GV3101(pGR107)及水作为对照实验。接种2周后对其检测及观察。
2.2.2.9 PCR检测接种GV3101(pGR107-ORF3)植株系统叶片（R Li et al，2008）
将1-2片接种系统叶片叠加在一起，称取100mg左右至研钵中，加入1.2mL （含0.2%巯基乙醇）CTAB缓冲液[5g CTAB 溶于150 mL ddH2O (温水浴)，5g
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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析
PVP 40,000，20.6g NaCl，10 mL (0.5 M, pH 8 )EDTA储存液，25 mL 1M（pH 8）Tris，最后用ddH2O定溶至250mL]充分研磨，转入1.5mL离心管中。65℃水浴中保温15-60min，保温过程中不时颠倒离心管，室温下13, 000rmp离心10min，取650?L上清至一新的1.5mL离心管中，加入650 ?L氯仿/异戊醇（24:1），涡旋震荡混匀30sec。室温下13, 000rmp离心10min，转移500 ?L层水相至一新的1.5mL离心管中，加入350 ?L异丙醇，反复颠倒数次，13,000rmp离心15min，小心地用微量移液器吸出上清回收总核酸沉淀。沉淀加入70%乙醇，13,000rpm离心10min，小心地用微量移液器吸出上清，室温下自然干燥10-15min。加入100 μL 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)并置于冰上10min，用微量移液器反复吹打液体使沉淀充分溶解，1%琼脂糖凝胶检测或-20℃保存备用。
用TBTV ORF3引物对所提叶片总核酸PCR检测，同时检测接种GV3101(pGR107)及水的植株系统叶做对照。
方法同2.2.2.7。
2.2.2.10 RT-PCR检测分别接种GV3101(pGR107-ORF3)及GV3101(pGR107)植株系统叶片
Trizol法提取分别接种GV3101(pGR107-ORF3)及GV3101(pGR107)植株系统叶片总RNA，方法同2.2.1.2。
用ORF3F/ORF3R引物RT-PCR检测接种GV3101(pGR107-ORF3) 植株系统叶片总RNA，方法同2.2.1.3；用CPF/CPR引物RT-PCR检测接种GV3101(pGR107) 植株系统叶片总RNA，方法同2.2.1.3。
2.2.2.11 电镜检测接种GV3101(pGR107-ORF3)植株系统叶片
取接种GV3101(pGR107-ORF3)植株系统叶片做负染。将样品加入0.01mol/L负染液（负磷钨酸负染液2%）800μL研磨，转入1.5mL离心管，8000rmp，1min；将上清于手套膜上将铜网正面向液体放置2min；用滤纸吸干铜网上的液体，放入PTA负染3次，2min/次；用滤纸吸干放入培养皿中保存。
2.2.2.12 Western blot检测检测接种GV3101(pGR107-ORF3)植株系统叶片总蛋白
用液氮研磨叶片，加入等体积蛋白上样缓冲液，用液氮反复洗冻3次，融化后100℃水浴10min，保存备用，点样前稍离心，取上清点样。
BL21（pET28a-ORF3）原核表达菌株及TBTV ORF3抗血清均由本实验室龙亚芹制备并保存。为检测植物叶片上TBTV ORF3，以含本实验室已构建好的原
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