烟草丛顶病毒ORF3的功能分析
核表达载体菌 (pET28a-ORF3)的BL21为阳性对照，以制备好的TBTV ORF3抗血清为一抗检测。
将保存的含原核表达载体菌(pET28a-ORF3)的BL21在LB（Amp）培养基中活化；活化好的菌液按1：100的菌及培养基LB(Amp)培养；取菌液在4℃、12,000 rpm 离心1min，弃上清。沉淀重悬于50μL蒸馏水，冰浴条件下进行超声波破碎2-4min后，在4℃、12,000 rpm 离心1min，取上清液，加入等体积的 2×SDS加样缓冲液中，100℃加热5min，悬液置冰上。待全部样品处理完后上样。
SDS-PAGE胶制备（萨姆布鲁克等，2002）(Bio-Rad公司单项蛋白电泳仪)
表2-2 SDS-PAGE分离胶及浓缩胶配方
Table 2-2 Formula of separation gel and stacking gel of SDS-PAGE 分离胶separation gel
H2O 30% Acr/Bis 1.5mol/L Tris(pH8.8)
10%SDS 10%APS TEMED
12% 1.6mL 2.0mL 1.3mL 0.05mL 0.05mL 0.002mL
将准备好的样品上样于SDS-PAGE上，电泳时浓缩胶电压为80V，分离胶电压为160V。
将SDS-PAGE电泳结束后的蛋白胶转膜，经SDS-PAGE电泳的凝胶在转移缓冲液中漂洗后，用微型Trans-Blot转印槽（北京六一DYCZ-40D转印电泳槽）将蛋白质从凝胶上转移到硝酸纤维素膜上；封闭时将转移后的硝酸纤维素膜在TBST中漂洗三次，每次15min，转入封闭液中（TBST稀释5%的脱脂奶粉），37℃封闭1小时或40℃过夜；第一抗体反应时，将封闭后的硝酸纤维素膜在TBST中漂洗三次，每次15min，然后转入TBST稀释的专化抗血清中，37℃反应1小
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浓缩胶stacking gel
H2O 30% Acr/Bis
5% 2.1mL 0.5mL
1.0mol/L Tris(pH6.8) 0.38mL
10%SDS 10%APS TEMED
0.03mL 0.03mL 0.003mL
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时；第二抗体反应时，取出硝酸纤维素膜在TBST中漂洗三次，每次15min，放入TBST稀释的碱性磷酸酯酶IgG(1:5000稀释)，37℃反应1小时；BCIP/NBT底物显色试剂盒显色（TIANGEN公司）时，取1mL 1×AP反应缓冲液，加50μL NBT溶液和50μL BCIP溶液，混匀，把经洗涤的PVDF膜浸入生色底物混合物中，于室温平缓摇动进行温育反应并细心观察反应过程，当蛋白带的颜色深度达到要求（一般20-30min）时，把浸入PVDF膜水中停止反应，拍摄膜照片或直接保存膜留作永久试验记录。
2.2.2.13 ELISA检测
酶联板预处理：4℃过夜；选取病叶用PBST研磨，4000rmp离心 10min；抗原包被，每孔加入100μL病叶研磨液，37℃，2h；PBST洗涤6次，每次间隔5min；加封闭液（含5%脱脂奶粉的PBST），37℃，2h；PBST洗涤6次；加入碳酸缓冲液稀释的抗血清100μL/孔，37℃，2h；PBST洗涤6次；加入封闭液1000×碱性磷酸酶标记二抗，37℃，2h；PBST洗涤6次；加酶标底物（PNP药片，使用前15min内配制）100μL/孔，30min；加3M NaOH终止反应，50μL/孔用酶标仪读数。
2.2.3 gfp基因的克隆
pGR208载体上带有gfp基因，根据pGR107载体上的多克隆位点Cal I/Smal I/Sal I设计带有SalⅠ/ClaⅠ酶切位点的引物GGFPF/GGFPR扩增gfp基因。
2.2.3.1 gfp基因的扩增
设计带酶切位点SalⅠ/ClaⅠ的引物，从pGR208载体上扩增gfp，片段长716bp。
GGFPF：CCATCGATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC GGFPR：ACGCGTCGACTATTTGTATAGTTCATCCATGC
2.2.3.2 PCR扩增pGR208载体上的gfp基因（TaKaRa公司rTaq DNA聚合酶）
方法同2.2.1.4。
2.2.3.3 PCR产物割胶回收gfp基因（Axygen公司割胶回收试剂盒）
方法同2.2.1.5。
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2.2.3.4 克隆载体pMD18-T与gfp基因连接（TaKaRa公司的T4连接酶）
方法同2.2.1.6。
2.2.3.5 大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备（萨姆布鲁克等译，2002）
方法同2.2.1.7。
2.2.3.6 转化及蓝白斑筛选（萨姆布鲁克等译，2002）
方法同2.2.1.8。
2.2.3.7 重组质粒pMD18-GFP提取（TIANGEN高纯度质粒小提试剂盒）
方法同2.2.1.9。
2.2.3.8 重组质粒pMD18-GFP的PCR鉴定
将重组质粒DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，选择滞后重组质粒进行PCR鉴定（TaKaRa公司rTaq DNA聚合酶），利用2.2.2.3中的特异引物对待检测质粒进行PCR扩增，方法同2.2.1.4检测gfp基因。
2.2.3.9 重组质粒序列测定
经PCR鉴定和酶切鉴定得到的含目的片段质粒的菌液，送北京博迈德进行基因测序测定，利用通用测序引物M13F对重组质粒进行序列测定并将部分菌液15%甘油保存备用。
2.2.3.10 gfp基因序列分析
将PCR检测正确的菌株DH5a(pMD18-GFP)送北京博迈德公司测序，测序结果与NCBI登录号为AB124780的GFP序列用DNAMAN软件进行核苷酸及氨基酸同源性比较及分析，确定获得的GFP序列变异在允许范畴并保证氨基酸序列能正确翻译。
2.2.4 pGR107-GFP-ORF3及pGR107-GFP载体构建
2.2.4.1 pGR107-ORF3、pGR107及pMD18-GFP载体的Sal I/Cla I酶切（Takara的Sal I/Cla I酶切体系）
重组质粒pMD18-GFP及双元载体pGR107-ORF3、pGR107 Sal I/Cla I酶切（反应体系20μL）, pGR107为对照。在0.5mL PCR管中加入10μL pMD18-GFP，2μL反应缓冲液H，1μL SalⅠ，1μL ClaⅠ，6μL ddH2O；同时在另一0.5mL PCR
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管中加入10μL pGR107-ORF3质粒DNA，2μL反应缓冲液H，1μL SalⅠ，1μL ClaⅠ，6μL ddH2O。将两个离心管分别混合均匀，37℃水浴过夜，取酶切产物5μl进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。
2.2.4.2 分别割胶回收目的片段gfp及pGR107-ORF3、pGR107酶切后载体片段（Axygen公司割胶回收试剂盒）
方法同2.2.1.5。
2.2.4.3 pGR107-ORF3、pGR107载体与gfp基因的T4连接(TaKaRa公司)
将双酶切的gfp及双酶切的pGR107-ORF3片段在T4连接酶的作用下连接，连接体系10μL。在0.2mL PCR管中加入1 μL双酶切的pGR107-ORF3片段，5μLGFP片段，1μL T4连接酶，1μL 10×连接酶Buffer，2μL ddH2O混合均匀后，4℃连接过夜。同样的方法设置双酶切的pGR107片段与双酶切的gfp基因片段连接。
2.2.4.4 农杆菌GV3101感受态细胞制备(卢圣栋，1999)
方法同2.2.2.4。
2.2.4.5 冻融法转化农杆菌(卢圣栋，1999)
方法同2.2.2.5。
2.2.4.6 pGR107-GFP-ORF3及pGR107-GFP质粒提取（TIANGEN高纯度质粒小提试剂盒）
方法同2.2.2.9。
2.2.4.7 PCR检测pGR107-GFP-ORF3及pGR107-GFP质粒的gfp基因片段
引物为GGFPF/GGFPR,反应体系25μL。方法同2.2.1.4。
2.2.4.8 含重组质粒pGR107-GFP-ORF3及pGR107-GFP的农杆菌GV3101注射接种本氏烟
方法同2.2.2.8。
2.2.4.9 免疫荧光显微镜检测接种pGR107-GFP-ORF3、pGR107-GFP的本氏烟各部位
接种2天后，将接种植株不同部位做徒手切片，免疫荧光显微镜观察植株各
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个部位并拍照。
2.2.5 免疫胶体金检测烟草丛顶病毒
利用已获得TBTV ORF3/ORF4抗血清对烟草丛顶病烟株进行免疫胶体金检测，可明确TBTV ORF3/ORF4基因在发病烟株细胞中的定位。
2.2.5.1 样品的低温包埋
取采自云南省保山市龙陵县通过介体蚜虫取食发病的烟草丛顶病样。将新鲜样品切成1×1×3mm3的小块，立即放入3%甲醛和1%戊二醛的磷酸缓冲液（100mM，pH7.2）中，4℃下固定2h；磷酸缓冲液（100mM，pH7.2）清洗3次，每次15min；在4℃依次用30%、50%乙醇溶液脱水，每次30min；在-20℃冰箱中依次用50%、70%、90%、100%、100%、100%乙醇溶液脱水，每次60min，100%乙醇处理时注意不断轻轻摇动样品；在-20℃冰箱中依次用30%、70%、100%的K4M渗透，每次120min，100%的K4M渗透过夜，注意不断轻轻摇动样品使渗透完全；置换新瓶，用100%K4M继续渗透6h；将样品包埋于K4M树脂的eppendorf管，注意包埋剂应尽量装满，否则气泡中的氧气会抑制包埋剂的聚合；在-20℃冰箱中长紫外线照射聚合72h，室温下聚合48h，注意每天翻动2次样品使紫外光照射均匀；聚合后的样品应及时切片，长时间放置会导致样品与包埋剂之间分离而无法切片；超薄切片应收集在镍网、金网或铍网上做免疫胶体金标记。
2.2.5.2 胶体金间接标记（在28℃下进行）
超薄切片厚50-70nm左右，载于200-300网孔的锦网上；ddH2O漂洗2min；BL封闭30min；一抗(ORF3和ORF4抗血清由龙亚芹制备)稀释100-300倍（BL稀释），30-60min；ddH2O漂洗3次，每次5min；胶体金标记抗体液稀释30-100倍，以淡红色液为适宜稀释液，标记30-60min；双蒸水漂洗3次，每次5min；4%醋酸双氧铀染色5min。
2.2.5.3 电镜观察免疫胶体金颗粒
在透射电镜（JEM100CX型透射电子显微镜观察）下找到样品，放大到适宜倍数后，调整视眼清晰度，在该放大倍数下寻找胶体金颗粒，金颗粒在视眼中为微小颗粒，找到金颗粒后，在将其放大到适宜倍数并调节视眼清晰度。在较好的视眼下拍照。
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