附录1
各种标本的采集方法
1．粪便标本：对水样便以吸管吸取1～3毫升，成型便采集成人拇指大小的便量，置于灭菌管内或经增菌后送检。任何容器均应加橡皮塞或将螺旋盖旋紧，容器外壁不可沾染粪便。采集肛拭子标本，以直肠拭子用保菌液或生理盐水润湿后，由肛门插入直肠内3～5厘米处采集，转动取出，插入保存液或无菌试管内送检。粪便标本应在2小时内尽快送检，否则标本应放入Cary-Blair运送培养基中。沾染粪便的衣物、物品、地面，以及尸体肠内容物等也可作为检材。所有采集的拭子标本（肛拭子、食品及操作台等的涂抹拭子），当直接用于PCR检测时，不能使用棉拭子和木质拭子棒，因为这类材料中含有核酸扩增抑制剂，而要使用灭菌人造纤维拭子和塑料棒。
2．呕吐物标本：以吸管吸取1～3毫升，置可密闭样品管立即送检。
3．食品标本：采集50～100克置于可密闭灭菌广口瓶、塑料瓶或厚的自封塑料袋内，常温下迅速送实验室。
4．水产品标本：通常选取活的或新鲜水生动物为采集对象，冰冻水生动物也可作为采集标本。采集水生动物鳃部和/或肠内容物等标本，置于采样瓶（管）或食品采样袋中密封，常温下送检；同时，以无菌棉签涂抹五只（条）以上的某类水生动物体表和/或水生动物肛门，置于碱性蛋白胨水中送检，每管碱性蛋白胨水作一份样品看待。有条件的可将水生动物整体采回实验室再进行处理。
5．水体标本：用灭菌的500毫升玻璃瓶采集相对静止的表层水（深度30厘米以内）500毫升，加盖密封后以牢固自封塑料袋包裹密封，常温下送实验室。取水点的选择应结合流行病学调查资料而确定；每个采样点应相距数米；同一采样点采集样本不少于2瓶，用于平行检测。采集标本的水体按可能污染有霍乱弧菌对待，因此采样者应注意自身防护，同时避免水样沾染周围环境。
6．物体表面标本：以灭菌拭子蘸碱性蛋白胨水涂抹可疑物体表面，置于装有碱性蛋白胨水的可密闭玻璃或塑料试管中，常温送检。 附录2
疫点消毒的实施方法
1 消毒原则
1.1 及时开展消毒工作：为减少传播机会，在接到疫情报告后城市应在6小时内，农
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村应在12小时内落实消毒措施。
1.2 消毒范围的确定：应以霍乱病人排出霍乱弧菌可能污染的范围为依据。 1.3 消毒持续时间：应以霍乱流行情况和病原体监测结果为依据。
1.4 消毒方法的选择：应以消毒因子的性能、消毒对象为依据。尽量避免破坏消毒对象的使用价值和造成环境的污染。
1.5对疑似霍乱病人的疫点消毒：按确诊霍乱病人的疫点进行消毒处理。
2 疫点的随时消毒
2.1医疗机构的防疫人员接到患者诊断与消毒通知单后，应立即到疫点指导随时消毒，必要时提供所需消毒剂和器械。
2.2 在病家，随时消毒由病人的陪伴或病人所在单位派人进行；在医院，随时消毒由医院安排专职人员进行。
2.3 交给病家使用的消毒剂，应标明名称和使用方法。 2.4 对病人应根据病情做到“三分开”与“六消毒”。
“三分开”：分住室、分饮食、分生活用具（包括餐具、洗漱用具、便盆、痰罐等）；“六消毒”：消毒呕吐物和排泄物、消毒生活用具、消毒双手、消毒衣服、被单、消毒患者居室、消毒生活污水。
2.5 病人的陪伴和护理人员，除做好病人的随时消毒外，应做好本人的卫生防护。特别在护理病人后，应消毒双手。
2.6 消毒指导人员与负责随时消毒人员，应共同填写疫点消毒工作记录，及时上报。必要时，采样进行消毒效果检测与评价。
3 疫点的终末消毒 3.1消毒的执行
在当地疾控机构的监督指导下，由医院防保医生负责进行终末消毒。 3.2 消毒程序
3.2.1 消毒人员接到传染病消毒通知后，应在规定时间内迅速赶赴疫点开展终末消毒工作。
3.2.2 在出发前，应检查所需消毒用具、消毒剂和防护用品，做好准备工作。 3.2.3 消毒人员到达疫点，首先查对门牌号和病人姓名，并向有关人员说明来意，做好防疫知识宣传，禁止无关人员进入消毒区域内。
3.2.4脱掉外衣，放在自己带来的布袋中（不要放在污染或可能受到污染的地方）。更换隔离服、胶鞋，戴上口罩、帽子。如用过氧乙酸或含氯制剂时，须戴防护眼镜。 3.2.5 仔细了解患者病前居住的房间、活动场所，用过的物品、家具，吐泻物倾倒或
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存放的地点，以及污水排放处等，以确定消毒范围，并根据不同对象及其污染情况，选择适宜的消毒方法。
3.2.6 进入疫点时，应先消毒有关通道。
3.2.7测量污染范围内需消毒的房屋及地面的面积和体积，以及需消毒的污水量。 3.2.8 必要时，检验人员对不同消毒对象进行消毒前采样。
3.2.9 消毒前应关闭门窗，将水缸盖好，将未被污染的贵重衣物、饮食类食品、名贵字画及陈列物品收藏好。
3.2.10 在关闭门窗前，应先于室内灭蝇，再进行其它消毒。
3.2.11消毒室内地面、墙壁、家具和陈设物品时，应按照先上后下，先左后右，依次进行。
3.2.12 病人用过的餐具、饮具及污染的衣物可在疫点内进行煮沸或浸泡消毒。作浸泡消毒时，必须使消毒液浸透被消毒物品。作擦拭消毒时，必须反复擦拭2～3次。对污染重、经济价值不大的物品如废弃物等，征得病家同意后进行焚烧。
3.2.13 室内消毒后，必要时对厕所、垃圾、下水道、自来水龙头或饮用水井等进行消毒。
3.2.14 对病人密切接触者进行卫生处理。
3.2.15 疫点消毒工作完毕后，先对消毒人员的衣物、胶靴喷洒消毒后再脱下。衣物脱下，将污染面向内卷在一起，放在布袋中带回消毒。将所用消毒工具表面以消毒剂进行擦拭消毒。
3.2.16 达规定的消毒作用时间后，检验人员对不同消毒对象进行消毒后采样。 3.2.17 填写疫点终末消毒工作记录。
3.2.18 离开病家前，告诉病家开窗通风，擦拭打扫。
4 消毒人员注意事项
4.1消毒人员在出发前要检查应携带的消毒工具是否齐备无故障，消毒剂是否齐全够用。
4.2 消毒人员应主动取得病家合作。在消毒过程中，应尽量采用物理消毒方法。在用消毒剂时应尽量选择对相应微生物杀灭作用良好，对物品损害轻微者。
4.3 消毒人员在消毒过程中，不得吸烟、饮食，更不要随便走出消毒区域。同时应禁止无关人员进入消毒区域内。
4.4 消毒人员工作时应认真细致，有条不紊，突出重点。凡应消毒的物品，不得遗漏。严格区分已消毒和未消毒的物品，勿使已消毒的物品被再次污染。
4.5 消毒完毕后，消毒人员携回的污染工作衣物应立即分类作最终消毒。清点所消耗的药品器材，加以整修、补充。填好的消毒记录应及时上报。
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附录3
霍乱弧菌的分离与鉴定
1 标本的收集
病人粪便、呕吐物、肛拭子为必取标本。水样便或呕吐物采样量一般为1ml～3ml，成形便采取指甲大小的粪量；肛拭子可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3cm～5cm处旋转后取出，置增菌液或运送培养基送检。
2 标本的送检
采得的标本应立即接种于培养基。不能立即接种的，应放入碱性蛋白胨水或文腊二氏保存液或插入Cary-Blair半固体保存培养基中送检。标本与保存液的比例约为1∶5。
3 分离培养
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3.1增菌后分离培养：所有标本均应接种碱性蛋白胨水培养基置37℃增菌6h～8h后，从菌膜下表层取一接种环培养物，划线接种于强、弱选择性培养基各一个置37℃培养18h-24h。必要时进行二次增菌培养。
3.2直接分离培养：对急性期病人水样便标本在进行增菌培养的同时可取一接种环或用肛拭子直接接种在选择性培养基上置37℃培养18h-24h。
3.3常用强选择性培养基包括庆大霉素琼脂、TCBS琼脂和四号琼脂等。弱选择性培养基一般使用碱性营养琼脂等。
3.4不同分离培养基上生长的霍乱弧菌典型菌落特征不同，常见分离培养基的37℃18h～24h培养物的菌落特征如下：
3.4.1碱性营养琼脂：霍乱弧菌在碱性营养琼脂上生长的菌落呈现为无色、圆形、透明或半透明、表面光滑、润湿、扁平或稍凸起、边缘整齐，菌落直径一般约为2毫米。 3.4.2庆大霉素琼脂和四号琼脂：菌落特征与碱性营养琼脂上生长的菌落相似，但透明性略差，多呈半透明状，由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深。
3.4.3 TCBS琼脂：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整齐。
4 菌株鉴定
4.1菌株初筛：包括玻片凝集实验、氧化酶试验。 4.1.1 玻片凝集实验
从分离培养基上挑取疑似菌落接种于非选择性培养基进行纯培养（37℃ 18h～24h），取纯培养物与O1群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体或O1群多价诊断血清及O139群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体或诊断血清做玻片凝集试验进行O1群和O139群霍乱弧菌的初筛。
玻片凝集试验使用的血清效价范围应为1∶32～1∶64。如玻片凝集试验在1分钟内出现肉眼可见的明显凝集块，但在生理盐水中不产生凝集的培养菌判为凝集阳性，应立即保存菌株做复核与分型鉴定；在1min内不出现凝集块者判为凝集阴性。
生长在碱性营养琼脂、庆大霉素琼脂及四号琼脂上的疑似菌落如足够大，可直接挑取疑似菌落与O1群霍乱弧菌多价诊断血清及O139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验进行初筛。但生长在TCBS培养基上的疑似菌落常因培养基中蔗糖的影响造成难于乳化，不能直接进行玻片凝集试验，应先以非选择性培养基纯培养后再作玻片凝集。
要注意同一标本存在O1群和O139群等多个血清群霍乱弧菌混合的可能，每份标本至少挑选5个以上的疑似菌落逐一进行鉴定。 4.1.2 氧化酶试验
试剂：1%盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液。
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