试验方法：取生长在非选择性培养基上的新鲜培养物涂抹在清洁的滤纸上，然后滴加上述试剂，如培养物在lmin～2min内出现粉红—紫红—紫蓝色，有的最后呈紫黑色，判断为氧化酶试验阳性；培养物不显色判为阴性。 4.2 菌株复核
经初筛阳性或可疑阳性的菌株，在发出初步鉴定报告的同时，应尽快送当地疾病预防控制中心（CDC）进行复核鉴定。复核结果符合O1群或O139群霍乱弧菌的菌株，按菌株管理的要求进行保存与上送；如复核结果出现疑问，应尽快将菌株上送省级或以上CDC（参比实验室）进行确认分析。菌株的复核鉴定应以纯培养物为基础，至少应包括以下项目：血清凝集试验与血清分型、革兰氏染色、粘丝试验、氧化酶试验、动力试验。对一次流行的首批病例菌株和玻片凝集反应不典型的菌株应增做试管凝集试验。
霍乱弧菌系统生化鉴定详见表1。
表1 部分弧菌科细菌的系统生化鉴定 项 目
霍 乱 弧 菌
拟 态 弧 菌
副 溶 血 弧 菌
创 伤 弧 菌
溶 藻 弧 菌
河 弧 菌
弗 尼 斯 弧 菌
海 鱼 弧 菌
霍 利 斯 弧 菌
麦 氏 弧 菌
辛 辛 那 提 弧 菌
最适生长温度37 37 37 37 37 37 37 25 25,36 37 25,35 37 （℃） 氧化酶 粘丝试验 硝酸盐还原 靛基质 V-P试验 尿素酶 L-赖氨酸 L-鸟氨酸 L-精氨酸 葡萄糖产气 乳糖
鲨 鱼 弧 菌
+ + + + - + + - -
+ + +
+ + + - + - -
+ + +
+ + + + - + - - -
25
+ + + - - - + - -
+ + - - - - + -
+ + - + + - + -
+ + - - - - - - -
+ + - - -/+ - +/- - +/-
+/- + - + - + - - - -
+ + + +/- + - - - -
+ - + +
+ +/- + + +/-
+/- +/-
+/- -
+ + - -
- +/- - + - - +
- -/+ -
- +/-
+ +/- +/- -
+ -/+
-/+ +/- -
麦芽糖 D-甘露醇 蔗糖 L-阿拉伯糖 纤维二糖 水杨素 明胶素 0% NaCl 3% NaCl 6% NaCl 8% NaCl 10% NaCl O/129敏感性 10μg 150μg
+ + + - - - + + + - - S① S①
+ + - - - - + + + - -
S S
+ + + + + + + - + - +
+ + + + - + - +
+ - - - - - - + + - S S
- - - + - - - - + +/- - - R S
+ + + - - - - - + + +/- - S S
+ - + + + + - - + + - - R S
+ +/- +/- - - - - - + + - - S
+ +/- + - -/+ + + - - + - + + -
R S
S S - + + + - + -
R S - - + - + +
- -/+ -/+ -
在不同盐量胨水中生长试验
+/- +/- + +/- + +/- +
- +/- -
R S
- R S
- +/- -
①部分O139群霍乱弧菌为抗性（R）。
26
附录4
霍乱实验室诊断的相关实验技术
1．霍乱弧菌毒素基因PCR检测
霍乱弧菌包含多种毒力相关因子，其中霍乱毒素是霍乱弧菌主要的致病因子，因此，在霍乱诊断上霍乱毒素基因（ctxAB）的PCR检测具有重要的诊断价值。该方法特异性和灵敏度均较高，需要在符合PCR实验条件的实验室中进行，同时需要严格的核酸提取操作。
扩增检测霍乱毒素基因ctxAB的引物为：
P1： 5’ – CTC AGA CGG GAT TTG TTA GGC ACG – 3’ P2： 5’ – TCT ATC TCT GTA GCC CCT ATT ACG – 3’ 扩增产物长302bp。扩增参数为： 预变性：94℃ min；
扩增循环：94℃ 30sec，68℃ 30sec，72℃ 30sec，共30个循环； 末轮延伸：72℃ 7min。
在不同厂商和型号的PCR扩增仪器上，退火温度可能略有不同。该方法直接检测是否为产毒株，需注意有时会出现由非产毒的霍乱弧菌引起的病例或小范围暴发。
2．霍乱弧菌快速辅助检测
目前使用霍乱弧菌胶体金快速检测法较多，该方法主要针对检测O1群和O139群霍乱弧菌抗原成分；操作简单。目前此类方法的检出限为105个菌/毫升，因此在轻型病例及带菌者调查中存在漏检的可能，需要进行增菌培养后检测，以提高检出率。 附录5
霍乱弧菌的鉴别诊断
27
1 副溶血弧菌肠炎
多数起病急骤，有食用海（水）产品或/和不洁食物史，潜伏期2h～4d，常先吐后泻，排便前往往有肠呜、阵发性腹部剧痛，常为水样或类似痢疾样脓血便，个别重型患者大便可有清水样或洗肉水样。早期常有发热和其他中毒症状。大便培养副溶血弧菌阳性。
2 大肠杆菌性肠炎
2.1产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)性肠炎，潜伏期4h～24h，有发热、恶心呕吐及腹部绞痛，腹泻，黄水或清水样便，无脓血便，严重腹泻者亦可产生重度脱水，婴幼患儿常因此而危及生命。
2.2 肠致病性大肠杆菌(EPEC)性肠炎，主要症状为腹泻，大便为黄色或黄绿色蛋花样便，量较多，常有特殊腥臭味；重者也会有脱水及全身症状。
以上两者粪便培养均可获得相应的大肠杆菌。
3 鼠伤寒沙门菌感染
侵犯各年龄组，6个月以内婴儿易罹患，新生儿病情尤为严重，多发生于5月～8月份，常有发热，可有腹泻或败血症，腹泻，大便为稀水便，亦可有脓血便，常引起不同程度脱水，大便培养可获得鼠伤寒沙门氏菌。
4 空肠弯曲菌肠炎
本菌可侵袭空肠及结肠引起病变。现已证实本菌亦可产生肠毒素而致病，潜伏期3d～5d，起病初期有发热或有乏力、头痛及肌痛等症状，继而腹痛腹泻，大便为水样、粘液状、胆汁样或呈血性。严重病例可有重度脱水及循环衰竭。个别患者还可表现为急腹症。一般典型病例不难与霍乱鉴别，大便培养可检出弯曲菌。
5 病毒性肠炎
常见病原为人轮状病毒，侵犯各年龄组，多见于婴幼儿，好发于秋冬季，可呈流行性，部分患者同时伴有上呼吸道感染症状及发热，中毒症状轻，常为自限性，腹泻次数可不多，大便稀软或黄水样，多无腹痛，成人病后常有1周～2周疲倦乏力。本病临床表现与轻型霍乱相似，但在流行中见不到与霍乱相似的中、重型病例，粪便培养霍乱弧菌阴性，轮状病毒检查阳性。其他如诺瓦克样（Norwalk-like）因子、腺病毒、冠状病毒、星状病毒等亦可引起腹泻，也需鉴别。
6 急性细菌性痢疾
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由志贺菌引起，潜伏期1d～3d，起病急，以发热、腹痛、腹泻、里急后重、脓血便为主要特征，有全身中度中毒症状。重症患者伴有惊厥、头痛、全身肌肉酸痛，也可引起脱水和电解质紊乱。不典型的急性菌痢以婴儿多见，多无全身中毒症状、不发热或低热，腹痛较轻，粪便呈水样或稀糊样，含少量黏液，左下腹可有压痛，应注意鉴别。急性中毒性菌痢可出现高热，在儿童患者早期出现烦躁、谵妄、惊厥等，发病初期肠道症状不明显，成人患者主要表现为脓血便频繁、循环系统症状明显。从粪便或肛拭标本等中检出志贺菌可确诊。
7 金黄色葡萄球菌所致腹泻
潜伏期短，从吃进食物至发病间隔为30min～8h，一般2h～4h。有严重的恶心、痉挛性腹痛、呕吐及虚脱，常伴有腹泻，病程短，常1d～2d，为常见的食物中毒，可呈暴发性。收集病人粪便、呕吐物、肛拭子、可疑食品检出金黄色葡萄球菌进行确诊。
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