总 论?
基因是遗传的基本单位，所以基因工程有时称遗传工程(genetic engineering),有时还称为基因克隆(gene cloning)、分子克隆(molecular cloning)。基因工程的基本技术是DNA重组技术(recombinant DNA technigue)，其定义是在分子水平上，用人工方法提取(或合成)不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合，然后将体外重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达。按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。了解这个概念要注意两个问题，第一就是必须有体外DNA的切割、连接、重组过程。第二，DNA重组必须是有目的的，按事先设计的过程进行，随意的切割、连接、重组过程不是基因工程。? 一、DNA体外重组的主要步骤?
DNA体外重组可分五个步骤。? (一)目的基因和载体基因的制备?
制备带有目的基因的DNA片段和载体基因。? 1．带有目的基因的DNA片段的获得?
带有目的基因的DNA片段的获得，主要有两个途径：一是从已有的生物基因组中分离；二是用酶学或化学的方法合成。?
从生物基因组中分离DNA片段主要是提取基因组DNA，对其进行酶切，获得特定的酶切片段。酶学合成目的基因DNA片段通常是以mRNA为模板，用反转录酶合成其cDNA作为克隆的片段。化学合成是对目的基因DNA片段在体外进行设计，并用化学方法进行合成，较大的基因一般分多段进行合成，并在体外连接成目的基因的片段。?
目前，用聚合酶链反应(PCR)对目的基因进行扩增或对目的基因转录产物RNA进行RT-PCR扩增，也是获得带有目的基因DNA片段的最常用方法之一。? 2．载体的选择?
DNA体外重组所用的载体是可以克隆DNA片段的DNA分子。目前常用的载体类型有质粒、噬菌体和动物病毒等。其中以质粒载体最常用。?
质粒(plasmid)是某些细菌中独立于染色体外的DNA，它有自主复制的能力，在细菌分裂时可伴随染色体分配到子细胞。它的存在与否，一般说来，对细胞的生存并没有决定性的影响。
根据复制是否受染色体复制功能所控制，质粒可分为严紧型质粒----即每个细菌细胞是可含1～3个拷贝和松驰型质粒----每个细菌细胞一般含10个以上拷贝。?
质粒具有不相容性，即在没有选择压力的条件下，两种不同的质粒不能稳定地共存于同一宿主细胞内。相互不相容的质粒属于同一不相容群；而属于不同的不相容群的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。?
许多质粒本身除作为一个复制子具有复制和调控系统外，还携带一些功能各异并赋予其
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宿主以不同表型特征的基因，如具有抗生素抗性等。作为一种克隆载体，能提供某种特殊表型，为其作为载体进行基因操作带来很大方便。?
由于天然质粒的这些基本特性，使其可用作克隆的载体，但并不一定是理想的载体。作为理想载体，它应该具备如下条件：?
(1)应该具有能自主复制的复制子，并且有能使所携带的外源DNA忠实复制、高效表达所需的调控系统。?
(2)对多种限制性核酸内切酶有单一切点，而且酶切点最好位于易于被检测的表型基因上。 (3)能够赋予宿主细胞易于检测的表型。? (4)分子量小，多拷贝。? (5)携带外源DNA的幅度较宽。?
(6)从生物防护的角度考虑，应当是安全的。? (二)目的DNA片段与载体DNA体外重组。?
将载体DNA与目的DNA片段剪切，并在体外进行连接，得到重组子。? 1．DNA分子的剪切?
对DNA分子的剪切，通常采用限制性内切酶进行酶解。除了酶解外，还可用化学降解和机械剪切法等方法对DNA分子进行剪切，不过这些方法因对DNA的剪切缺乏特异性，较少使用。
2?DNA分子的连接?
带有目的基因的DNA片段与载体DNA，由限制性内切酶作用产生的末端相结合形成结合体时，在接头处需要DNA连接酶把缺口修复，形成一完整的双链。大肠杆菌产生的和T4噬菌体感染的大肠杆菌产生的DNA连接酶，均能封闭双链DNA上相邻核苷酸之间的单链缺口。它们催化的反应十分类似，但它们所需要的辅助因子不同。T4 DNA连接酶需要ATP，而大肠杆菌DNA连接酶则需要NAD。这两种辅助因子在反应中分别释放出焦磷酸(PPi)和烟酰胺单核苷酸(NMN)的同时，均形成酶-AMP复合物。这种复合物同时表现出一个5′-磷酸和3′-OH基团的缺口结合，并在磷酸二酯链上形成一个共价键。连接DNA缺口的最适温度是37℃，但在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此，连接粘性末端的最适温度是介于酶作用速率与末端结合速率之间，大约15℃。? 将DNA片段连接成为人工重组体的方法有四种。? (1)粘末端法?
用限制性内切酶产生单股粘末端。两种DNA片段都用同一种限制酶降解，产生相同的粘末端。在退火条件下，末端单股间碱基配对，在DNA连接酶作用下，共价连接封闭成新的DNA分子。 (2)接尾法?
用末端核苷酸转移酶在DNA片段上制造一个粘末端，如在外来DNA片段3′-端加一小段单股的poly(dA)或(dG)，在载体DNA的3′-端加上一段Poly(dT)或(dC)，利用
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Poly(dA)·Poly(dT)或Poly(dG)·Poly(dC)形成碱基配对，两片段用连接酶连接起来。? (3)平末端法?
有些限制酶(如EcoRⅤ)切割产生的DNA片段不具有粘末端，而是平末端。如用其他方式产生的片段，用对单股DNA特异的核酸酶S1修平，或DNA聚合酶Ⅰ补平而形成的平末端，亦可通过T4DNA连接酶作用，连成新的DNA分子，但效率低，只有粘末端的1%。 (4)人工接头法
有时我们所需要的DNA片段不含有适于产生粘末端的限制酶识别序列，可通过人工合成的或利用现有的DNA片段上的限制酶识别序列，加在外源基因片段或分子载体上，使它们具有限制酶的新切点。由于此法的应用，几乎可使所有的DNA片段插入现有的载体分子中去进行无性繁殖。这种化学合成的具有限制酶末端的片段称为人工接头，用它可以把平末端的片段连接起来。用平末端连接法将人工接头接在待克隆的基因的两端，然后用限制酶(如EcoRⅠ)处理，产生具有粘性末端的片段，这些片段便能连到已用相同限制酶处理过的载体分子上。借助这种人工接头，产生了位于外源DNA两端的限制酶识别序列，使得外源DNA在宿主菌中克隆化和扩增之后，能恢复原状。?
DNA分子连接反应在高浓度DNA溶液中进行，可增加重组体的产率比例。在稀溶液中，由于分子间反应频率下降，有利于线性片段发生环化。用碱性磷酸酶处理线性化的质粒载体DNA去掉5′-磷酸，便阻止了环化作用和质粒二聚体的形成。只有插入未经磷酸酶处理的外源DNA片段提供5′磷酸，才能使载体环化。? (三)重组体转入受体细胞。?
外源基因DNA片段与载体组成的重组体，需先转化入受体细胞，才能进行增殖与表达。把重组质粒DNA转入受体细胞叫转化，把重组噬菌体或重组病毒DNA引入受体细胞叫转染。转化的成功与否，首先要使受体细胞处于感受态。大肠杆菌被广泛采用作为受体细菌。使受体细胞呈感受态最简便的方法是用0.01～0.05mol/L氯化钙处理，加入重组体DNA，置低温温育后，在42℃短时间热冲击来提高转化率，然后缓慢加入培养基，生长后在培养基平板上筛选转化子。?
(四)重组体克隆的筛选与鉴定?
重组DNA分子上如含有的基因是由纯化的mRNA合成的cDNA或PCR产物，只需作少量筛选即可获得所需克隆。但若要从基因库中选出某一特定基因，那么筛选工作就比较复杂。?
重组体的选择主要有以下几种方法：?
(1)通过表型直接筛选(利用载体的遗传标志：抗生素抗性、噬菌斑形成等)；? (2)菌落或噬菌斑原位分子杂交；? (3)免疫化学法；? (4)遗传互补法。?
筛选出重组体后，还必须对重组体DNA进一步鉴定。一般作凝胶电泳鉴定，酶切图谱分析及PCR分析等。除此之外还可采用基因产物分析或对核苷酸序列分析等方法进行鉴定。?
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(五)外源基因表达产物的分离纯化?
由于表达载体不同，外源基因表达产物存在形式不同，有的以融合蛋白形式存在，有的以包涵体形式存在，有的分泌到细胞外，具体分离纯化方法应根据表达产物的性质及表达产物在细菌培养物中的存在形式设计分离纯化方法。
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实验一 PCR技术?
总 论?
一、基本原理?
PCR的原理与体内DNA复制的过程相似，是由三个基本反应组成的循环性过程。? 1．变性：加热将所要扩增的双链DNA解链成单链DNA，?
2．退火：使温度下降，寡聚核苷酸引物与所要扩增基因两侧DNA按碱基配对原则结合。? 3．延伸；在适当的缓冲液中，Mg2+及4种dNTP存在下，DNA聚合酶能忠实地按模板的碱基顺序合成互补链，即从引物的3′-OH延伸，方向为5′ 3′。可合成与模板顺序完全相同的DNA。?
变性、退火、延伸三步反应反复循环，每循环一次所生产的DNA均能成为下一次循环的模板。n为循环次数，因此20次PCR循环将产生约一百万倍(2)的扩增产物。? 二、影响PCR的因素? 1．耐热DNA聚合酶?
(1)背景：耐热DNA聚合酶是从水生栖热菌(Thermusqauaticun,Taq)中分离出的热稳定性DNA聚合酶。Taq酶是从水生栖热菌菌株YT中分同的DNA聚合酶，该菌能在70～75℃的环境中生长，1969年从美国黄石国家公园的一个温泉中分离出了这个菌侏。
?由于采用了耐热DNA聚合酶，才必变了PCR的命运，使PCR广泛应用成为可能。一开始PCR所用的酶是大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow片，由于该酶不耐热，在一个循环中，变性之后都要加酶，20次循环要加20次酶，这样PCR反应成本很高，一般实验室无法开展工作。每次都加酶，也使反应复杂。?
自1987后,TaqDNA聚合酶被纯化和使用后，PCR技术就在分子生物学的各个领域等于到了非常广泛的应用。从这个意义上讲，是TaqDNA聚合酶给PCR技术注入了新生命力。当然，PCR技术也促进了TaqDNA聚合酶 的研究，使TaqDNA聚合酶的因很快被克隆并在大肠杆菌中表达，酶的产率存了很大提高，使重酶成本大大降低。? (2)性质：(以TaqDNA聚合酶为例)? ①温度与酶活性? 最适温度75～80℃? 70℃延伸率 60NT/S 55℃ 24NT/S 37℃ 1.5NT/S 22℃ 0.25NT/S 〉90℃无DNA合成
虽然90℃以上不能合成DNA，但较稳定。92.5℃作用130min,活力保持50%，95℃可耐受40min，97.5℃可耐受5 ～ 6min。PCR中，变性温度95℃30秒，50次循环之后，Taq聚合酶活性仍可保持75%。?
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