实验七 DNA酶切
一、原理? 1．三类限制酶?
限制酶特异地结合于其识别的特殊DNA序列之内或附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。限制酶可分为3类。Ⅰ类和Ⅲ类限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰(甲基化)作用及依赖于ATP的限制性酶切活性。Ⅲ类限制酶在识别序列上切割DNA，然后从底物上解离。在基因工程中Ⅰ类和Ⅲ类限制酶都不常用。常用的是Ⅱ类限制酶。? 2．Ⅱ类限制酶?
Ⅱ类限制酶又可分为二种酶，一种是限制性内切酶，它切割某一特异性的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它使识别序列甲基化。?
基因工程中常指的限制酶或限制性内切酶就是第一种Ⅱ类限制酶。? 3．限制性内切酶?
(1)识别序列一般为回文对称型，如EcoRⅠ识别序列为：?
5′?GAATTC?3′? 3′?CTTAAG?5′?
对称轴两则等距离的碱基两条互补链识别序列完全一样。? (2)识别序列长度大多数为4～6个核苷酸。? (3)同裂酶(同切口限制性内切酶)?
一般说来，不同的限制性内切酶识别不同的序列。然而有一些从不同来源分离的酶能在相同靶序列切割。这些酶称为同裂酶(Isoschizomers)。?
有一些识别四核苷酸序列的酶识别序列在另一种六核苷酸识别序列之内，如MboI和Sau AⅠ，识别序列在Bam HI之内。?
两种酶切割后得到相同末端，所以这两种酶产生的片段可以连接。? (4)来源及命名?
一般采用Smith和Nathans(1973)提出的方法对限制性内切酶进行命名，以产生该酶的微生物属名的第一个字母(大写)种名的前两上字母(小写)，以及菌株型号或质粒、噬菌体名称组成。例如，从Bacillus amyloliquefaciens H中提取的性内切酶称为Bam H；从Haemophilus influenzae Rd中提取的限制性内切酶称为Hin d；从Escherichia Coli RT中提出的酶称为Eco R(大肠杆菌耐药质粒RI)。在同一型号细菌中的几种不同酶可以编成不同的号，如Hin dⅡ、Hin dⅢ、HpaⅠ、HpaⅡ、MboⅠ、MboⅡ等。? (5)限制性内切酶的星活性?
一般来说，限制性内切存在严格的识别在序列特异性，但某些条件改变，会使其对识别序列特异性的放宽，而导致在DNA内产生附加切割，限制性内切酶表现的这种活性称为星活性，或第二活性，在名称右上角加一星号表示。?
产生星活性的条件：
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①甘油浓度?
②离子强度 高盐缓冲液酶降低盐? ③pH值 7.5～8.5产生?
④有机溶剂 DMSO(二甲亚砜)1～2%(V/V)? ⑤二价阳离子Mn2+?代替Mg2+?? ⑥酶与DNA的比例?
酶与DNA比为(50U/μg)产生星活性。为了防止星活性的出现，所有限制性内切酶反应在标准条件下(特别是pH、离子强度、二价离子浓度的条件下)进行。? 4．影响限制性内切酶反应的因素?
限制性内切酶能否有效、特异地切割DNA，最关键的因素有? (1)底物DNA的纯度与物理特性? A．纯度?
酶切反应要求最严的成分是底物DNA，酶切产物直接受DNA底物纯度的影响。? 提取过程中的酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl均能干扰反应，有些甚至改变识别序列特性，处理办法为酶切前透析或乙醇沉淀。? B．DNA浓度?
DNA浓度太稀加量大，含有EDTA影响结果。? C．识别序列位点，及与其邻接的特异性。?
限制性内切酶对DNA序列显示高度特性，因此，识别序列内核苷酸的甲基化或糖苷化都会影响酶切反应，识别位点接近末端的程度也影响切割，如EcoRⅠ要求识别序列后在末端至少有一个碱基存在才能切割。? D．DNA的二级/三级结构?
识别/切割位点的二级和三级也影响酶切效率，切割超螺旋比线状需要更多的酶。? (2)反应系统?
A．缓冲液 pH、Na?+离子? B．金属离子Mg2+??
C．甘油能使酶稳定，防止长期低温(-20℃)保存时发生冻结。甘油会使很多酶的识别特异 性下降，酶切反应含甘油量应低于5%。? D．水，无机离子?
(3)反应体积：酶浓度及EDTA? (4)保温时间与温度? 二、方法? 1.制备质粒DNA。?
2．对质粒DNA进行定量，并调整至0.2μg/μl。 3.取一支0.5ml微离心管，加入：
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成分Component 10×Buffer 酶1(10U/μl) 酶2(10U/μl) ddH2O Total volume
?10 000r/min离心5s 混匀,37℃水浴60min。?
体积volume 1μl 0.5μl 0.51μl 3μl 10μl
Plasmid DNA (0.2μg/μl) 5μl
3.取酶解样品，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶解效果。 三、试剂? 1.10×缓冲液。? 成分为：?
60mmol/L Tris-HCl(pH7.9)? 1．5mol/L NaCl? 60mmol/L MgCl2? 10mmol/L DTT? 2.电泳缓冲液：?
40mmol/L Tris-HCL(pH8.0)? 20mmol/L NaAC? 2mmol/L EDTA?
配制方法：先配50倍电泳缓冲液，用时取5ml，重蒸水稀释至250ml。? 3.溴酚蓝指示剂：?
称取溴酚蓝200mg，加重蒸水10ml，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖50g，加蒸馏水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后加重蒸水定容至100ml，加10mol/L NaOH 1～2滴，调至蓝色。?
4.EB：(10 mg/ml 溴化乙锭)? 5.琼脂糖? 四、仪器设备：
恒温水浴箱、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、紫外检测仪 五、说明?
1.酶切时所用DNA的量根据不同需要可有所增减。切点增多，所用DNA量亦相应增加。但是，所用DNA溶液的体积不能太大，否则，DNA溶液中其他成分会干扰酶反应和电泳。? 2.酶活性通常用酶单位表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1μgλDNA的酶量为一个单位。但是，许多实验室制备的DNA不象λDNA那样易于降解，需适当
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增加酶的用量。职有必要，可以用不同的酶量做试验，以决定最适酶量。反应液中加入过量的酶不合适，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的连接反应。?
3.市售内切酶一般浓度很大，为节约起见，使用前，可事先用酶反应缓冲液(1x)进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验时，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。?
4.延长反应时间，通常可以弥补酶量的不足，但是这对一部分酶不适用，随着反应时间的延长，这些酶的活性迅速下降。?
5.在制作酶切图谱时，有时需要用二种酶切割DNA样品，如果这两种酶反就条件一致，可将 酶一起加入反应液。如果二种酶所需缓冲液不同，可采用下列方法：?
a.将要求低盐浓度缓冲液的酶先反应，然后加入适量的盐溶液和第二种要求较高盐浓度缓冲液的酶。?
b.第一个反应在较小的体积下进行，然后用第二种酶要求的缓冲液稀释。?
c.第一个反应完成后，用等体积酚/氯仿处理，水相加0.1倍体积3mol/L醋酸钠和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心，干燥后进行第二个反应。?
d.有些生产酶的公司，对双酶同时反应进行了研究，对双酶反应提出了推荐使用的缓冲液，使用所推荐的一种缓冲液，可同时用二种酶对DNA进行酶切。?
6.从冷藏处取出酶(包括各种工具酶)，应立即放入冰水中。每次均应用清洁和消毒的吸管应避免限制酶被DNA或其他酶所污染。酶自冰箱取出后，应迅速操作将酶立即放回冷冻处。 7.如果酶切反应体积太大，电泳凝胶槽中装不下时，可用下列方法浓缩DNA；加入EDTA 1/3体积及2份乙醇，于干冰/甲醇浴中冷却5分钟，然后在台式高速离心机上离心5分钟。弃去上清液，其中含有较多蛋白质，可在真空下干燥沉淀。将DNA溶解到适量的TE液。? 8.如果需纯化限制性内切酶酶节的DNA片段，可用酚/氯仿提取一次，再用氯仿提取一次，用乙醇沉淀DNA。?
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实验八 DNA Southern blot分析
一、原理
Southern杂交，通过对特异性探针结合的基因组DNA片断内或其周围序列进行限制性内切酶切位点作图来研究基因在基因组内部是如何组织排列的。基因组标记的DNA探针先用一种或几种限制性内切酶消化，消化后的片断通过标准琼脂糖电泳按大小进行分离。然后DNA经过原位变性，从胶上转移到固相支持物上。附着于膜上的DNA可以与标记的DNA、RNA或寡核苷酸探针杂交，通过特定的检测方法可以确定与探针互补的带的位置。
Southern杂交目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。 二、方法
（一）细胞基因组DNA的提取
1．吸除原培养基，经胰酶消化转移至1.5ml 离心管中； 2．1000rpm 离心 10min ,去上清；
3．加入200－500ul lysis buffer 55℃ 孵育4－16小时； 4．加入等体积的 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），振荡混匀1min； 5．14000rpm 离心5min; 上清转移至另一干净的离心管中； 6．重复抽提一次；
7．上清转移至另一干净的离心管中，加入1/10 体积的NaAc ,3倍体积的无水乙醇，－20℃
沉淀过夜。（或－70℃ 2h） 8．14000rpm 离心10min,去上清； 9．70%乙醇清洗沉淀2次,室温干燥10min; 10．加入50－100ul TE 55℃ 3-4h溶解沉淀; （二）探针的标记：
1．探针标记：(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ,boehringer Mannheim Cat.No.1585614)
2．依据DNA浓度，在PCR管中加入1ug模板DNA（PCR回收产物），加水至16ul。 3．沸水中，水浴10分钟，迅速放入冰无水乙醇中。 4．加入4ul DIG-HIGH Prime,混匀，短暂离心。 5．37℃水浴孵育1－20小时（过夜）。
6．加入2ul 0.2M EDTA(PH8.0),终止反应。（或65℃，10分钟） （三）地高辛标记southern杂交步骤 1 酶切电泳
1.1 取10-20ug基因组DNA稀释到500ul合适的酶切限制性缓冲液中。4℃过夜。 （消化基因组DNA时的困难常常是由于DNA成团。稀释后常可解决此问题）
1.2 每管加入10-20U限制性内切酶。孵育4-6小时。可取10ul消化液琼脂糖电泳，检测消化程度。(完全消化的基因组DNA应该以从12kb-0.5kb连续地片状迁移。在成片的DNA顶
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