部应该没有浓缩条带。根据所用的限制性内切酶，你还可能在成片DNA中看到卫星条带，这些条带是分开的。)
1.3 用乙醇沉淀消化物：加50ul 3mol/L NaAc,混匀。后加1ml乙醇并混匀。在-20℃至少放置30min；离心20min,14000rpm。去上清。
1.4 用70％乙醇清洗一次：加1ml 70％乙醇，14000rpm 5min。去上清。离心5s使残余液体流到管底。吸掉液体。空气中干燥15min。
1.5 用TE（PH8.0）重悬沉淀。（TE的体积取决于凝胶孔的大小，样品包括染料，应加满约3/4孔的体积。时间允许可室温放置30min-1h 以使沉淀完全溶解）
1.6 缓慢电泳：0.7%琼脂糖凝胶（4－5mm厚）电泳，跑过夜或一整天（2.5V/cm凝胶长度） 1.7 切掉凝胶四周多余部分，并在凝胶的一角作一记号，拍照，记录电泳结果(拍照时，凝胶旁放一尺子)。 2 凝胶变性与转膜
2.1 凝胶在碱性变性溶液中进行DNA变性
2.1.1 室温下将凝胶浸于数倍体积（没过胶）的碱性变性缓冲液中15min并轻轻振荡； 2.1.2 换液一次继续浸泡凝胶20min，并轻轻振荡。
2.1.3 弃去变性缓冲液，水中清洗1遍，加入数倍体积（没过胶）的中和缓冲液。室温不断振摇30min（2×15min）。
2.2 组装转移装置及在碱性溶液中转膜 (注意：在拿尼龙膜时应戴无粉末的橡胶手套，用钝镊子夹膜的边缘。)
2.2.1准备DNA从凝胶向膜转移的平台，将1张待用尼龙膜和3张厚滤纸切成与待转移胶相同大小，并在尼龙膜一角做一标记。
另1张厚滤纸切成与凝胶相同宽度，长度(约18cm)足以达到转移液盒子的底部。 将待用尼龙膜用蒸馏水浸湿后，再浸入碱性转移缓冲液中。 安装毛细管转移装置
A．将长的滤纸放在转移平台的顶部，滤纸两端达到转移盒的底部，做成虹吸桥。 B．将8 0mL转移液倒入转移盒内，并湿润滤纸。
C．将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上，凝胶与滤纸间避免有气泡。 D．用保鲜纸封住凝胶四边。
E．将浸湿的转移膜置于凝胶的上部，凝胶与膜间避免有气泡。
F．将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面，并放一叠吸水纸搭在滤纸上，再放一 玻璃板，其上压一重物。
G．转移几小时或过夜(至少4小时) 注意：勿使转移液干枯。
2.2.2 DNA转移需要8－24小时，当纸巾湿润后更换新的纸巾。尽量避免整叠纸巾都被缓冲
液浸湿。
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2.2.3 除去凝胶上的纸巾及吸水纸。翻转凝胶以及与之接触的膜，凝胶向上平放与干燥的吸
水纸上。用笔标记加样孔的位置。
2.2.4 将凝胶从膜上剥离，弃去凝胶。采用紫外交联固定DNA： A．将膜放在浸有10 X SSC的厚滤纸上，有DNA的一面朝上。 B．将膜置于UV crosslinker 中，在紫外光下自动交联。
C．用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜，直接用于杂交或空气中干燥保存备用。 （此膜可在4℃长期保存。） 3 预杂交与杂交 3.1 预杂交
将适量（20ml/100cm）的预杂交液DIG Easy Hyb在42℃预热。放入印迹膜，在42 ℃
预杂交2-3h。 3.2 杂交 3.2.1准备探针
水煮地高辛标记的探针(5-25ng)10min使变性，并立即放在冰上2min。
3.2.2加适量(5-25ng)的探针到已预热的杂交液(2.5ml/100cm)中，混合均匀(避免形成泡
沫，影响杂交效果)。
3.2.3 倾倒预杂交液，将探针和杂交液的混合液加入膜中。 3.2.4 42℃杂交16小时。 3.3 洗膜
3.3.1将杂交液倒出，储存起来可再次使用。
3.3.2用25mL的2 X SSC，0.1% SDS 在室温摇动洗膜2次，每次5min 。
3.3.3用已预热的30mL 0.5XSSC,0.1%SDS 在68℃摇动洗膜2次，每次15min (用杂交炉)。 4 免疫检测
4.1用10mL冲洗液洗膜1-5min。(washing buffer)
4.2膜在100 mL封闭液（buffer 2）中孵育30-60min。(轻轻搅动，同时准备anti-DIG-AP。) 4.3 将anti-DIG-AP用buffer 2配成75mU/ml (1:10000稀释)。 4.4倒掉封闭液，将膜和20 mL抗体anti-DIG-AP孵育30min。
4.5倒掉anti-DIG-AP，在100 mLwashing buffer中洗膜2次，每次15min。 4.6在20ml detection-buffer 中平衡2－5min。
4.7将膜的有DNA的面朝上,放在保鲜纸上，滴数滴CSPD ready-to-use 覆盖膜，然后，立即用保鲜纸包裹，挤掉多余的CSPD ready-to-use，使其均匀平铺在膜上，没有气泡，但避免使膜干掉。室温孵育5min。
4.8在37℃孵育潮湿的膜10min（5-15min）。增强发光。
4.9用Lumi Film或X-光底片将杂交膜进行室温曝光15-30min。(发光性能至少可持续48小时)
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4.10 X-光底片的冲洗
Agfa 30显影液显影(1-5min)---冲水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水冲洗---晾干底片 三、试剂的配制： Lysis buffer:
100Mm Tris-HCL (PH 8.5) 5mM EDTA 0.2% SDS 200mM NaCL
100ug/ml Proteinase K (20mg/ml Proteinase K stock is stored at -20℃ andded
to the Lysis buffer prior to use.)
酚：氯仿：异戊醇 （25：24：1）
TE buffer (10Mm Tris-HCL PH8.0 , 1mM EDTA ) 3M NaAc PH 5.2
PBS (NaCL 8g/L, KCL 0.2g/L, Na2HPO4 1.44g/L, KH2PO4 0.2g/L) Trypsin/EDTA (0.25%Trypsin, 1mM EDTA 2Na)消化液 变性缓冲液：0.5mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCL
中和缓冲液：0.5mol/L Tris-cl (PH7.5), 3mol/L NaCL 碱性转移缓冲液：0.4mol/L NaOH, 1mol/L NaCL 四、仪器设备：
恒温水浴箱、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、紫外检测仪、暗盒、杂交炉、紫外交联仪等。
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实验九 真核细胞RNA的提取
一、原理?
本方法利用将TRIzol一步法进行总RNA提取的实验方案。 二、方法?
（一）样本制备和保存 1、组织样本的制备 1）动物组织
1) 首先准备好用于包装样本的铝箔或冷冻保存管，并且用油性记号笔在铝箔或冻存管外表多处写明样本编号。
2) 准确切除所需组织后，立即在冰上剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型。 3) 在RNase-free 的生理盐水中迅速漂洗样本，以去除血渍和污物。 4) 用准备好的铝箔或冷冻保存管装载包裹组织，迅速投入液氮冷却。
5) 做好实验记录，写明样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。 注意事项
（1) 包裹组织的铝箔或冷冻保存管转入样本袋时，按以下步骤进行：把样本袋（纱布袋等）放入液氮中冷冻一下，而后将液氮冷却的组织放入样本袋（每个样本袋只保存同样的组织，样本较多时应分装至多个小袋，不要在一只样本袋中放过多的样本以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出），袋口留一根编号绳，绳上粘标签纸（标签上注明：样本名称、编号、日期），迅速转入液氮罐。
（2) 不要用Eppendorf管保存组织样本，因为Eppendorf管从液氮中取出时极易发生管子爆裂而造成样本损失。
（3) 在采集临床标本时，如果时间不允许进行样本清理，就立即将样本投入液氮中以确保样本的质量。 2、细胞样本的制备 1）贴壁细胞
（1) 贴壁细胞培养诱导结束后，去除培养液。
（2) 按每10 cm细胞加2 mL TRIzol试剂的比例加入TRIzol试剂。 （3) 缓慢旋转培养瓶数次，使TRIzol试剂充分接触培养瓶表面进行消化。
（4) 转移到RNase-free的试管中用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，使之充分溶解于TRIzol中形成清亮不粘稠的液体。
（5) 进行后续的RNA提取实验或者是放入干冰或-80℃冰箱中保存。
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2）悬浮细胞
（1) 悬浮细胞培养诱导结束后，离心去除培养液。
（2) 按照每5×10个细胞加1 mL TRIzol的比例加入TRIzol试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，使之充分溶解于TRIzol中形成清亮不粘稠的液体。 （3) 进行后续的RNA提取实验或者是放入干冰或-80℃冰箱中保存。 3）全血样本的白细胞分离
（1) 在已加入抗凝剂的新鲜全血中加入等体积PBS（1×），充分混匀。
（2) 缓慢转入另一已加入淋巴细胞分离液的离心管中，并使上述混合液处于淋巴细胞分离液液面之上（即两种液体不要混合，保留清晰的界面），3000 g离心30 min。
（3) 用移液枪小心分离出白细胞层；用PBS（1×）清洗白细胞，离心回收白细胞，弃去上清。
（4) 加入白细胞20倍体积的TRIzol试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，使之充分溶解并形成清亮不粘稠的液体。
（5) 进行后续的RNA提取实验或者是放入干冰或-80℃冰箱中可以保存半周左右。 注意事项
（1) 未经TRIzol试剂处理的细胞样本不要保存。
（2) 如果样本是冻存可复苏的细胞株，应首先验证所用冻存方法用于RNA提取的可靠性，以便确保实验成功。
（3) 血液样本保存是不稳定的，新鲜血液必须立即分离出白细胞或者直接提取RNA进行保存。
（4) 白细胞样本保存也是不稳定的，白细胞样本务必按照上述过程进行保存。 （5) 不要在-20℃冰箱中保存RNA或者白细胞样本。 （二）总RNA提取 1. 试剂使用量
1） TRIzol的使用量： 2） 氯仿的使用量：
每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿。
3） 异丙醇的使用量： 每1 mL TRIzol加入0.5 mL异丙醇。 4） Milli-Q水的使用量：根据沉淀的大小确定。
2. 实验过程
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