成分 10×连接Buffer
回收的PCR产物（100ng/μl）
T载体（50ng/μl） T4DNA连接酶（6WeissU/μl）
ddH2O 总体积
10 000r/min离心5s混匀。?
用量 1 5 1 1 7.0 15.0
放在调好16℃的保温瓶内，并将保温瓶装盖严，置4℃冰箱冷藏式放置过夜。? 三、试剂?
1．10×T4DNA连接酶缓冲液? 660mmol/L Tris-HCl(pH7.5)? 55mmol/L MgCl2? 50mmol/L DTT? 10mmol/L ATP? 2．无菌水? 3．T4DNA连接酶? 四、说明? 1．连接缓冲液?
现使用的缓冲液多数是随商品连接酶由厂家同时提供的。也可自己配制。常用的缓冲液为Tris-HCl溶液，pH7.5,使用时需加含-SH的化合物如疏基乙醇和二硫苏糖醇，还应有一定浓度的Mg2+及新鲜未降解的ATP。除此之外，还常加入一定量的牛血清白蛋白。为了保证ATP不被降解，每次要用新鲜的，也可直接配制在连接缓冲液中，因为在连接缓冲液中ATP比较稳定。连接缓冲液应在-20℃冰箱中保存，储备液不可反复冻融，最好配制后分装保存。 2．DNA连接酶用量?
T4DNA连接酶的量以Weiss单位度量。1Weiss单位是20分钟37℃催化1nmol［P］焦磷酸转化到［P］ATP的酶量。连接酶用量与DNA片段的性质有关，如果需要连接平齐末端，必须加大酶量，一般用连接粘性末端酶量的10～100倍。连接平齐末端时，还可加入T4RNA连接酶，在T4RNA连接酶存在下，可使平齐末端的连接效率提高数十倍，但对粘性末的连接并无影响。?
3．连接带有粘性末的DNA片段时，DNA浓度一般为2～10μl/ml,连接平齐末端时，需加大DNA浓度至100～200μg/ml(这里浓度的计算以假定DNA片段长度为200～5000bp对为前提)。提高DNA浓度将促进分子间的连接，降低浓度对分子本身环化有利。?
4．连接反应后，反应液可在0℃储存数天，-8℃储存2个月。但是，在-20℃冰冻保存将会
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降低转化效率。?
5．粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定。所以，尽管T4DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，温度以15～２０℃为宜。?
6．5mmol/L ATP将完全抑制T4DNA连接酶连接平齐末端，而181mmol/L ATP才能抑制粘性末端的连接。连接反应液中ATP浓度一般在0.5-1mmol/L范围内。?
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实验五 重组DNA的转化??
一、原理? 1．转化的概念?
外源基因DNA片段与载体组成的重组，需先进入受体细胞，才能进行增殖与表达。以质粒为载体得到的重组体或重组子是重组质粒。把重组质粒DNA转入受体细胞(菌)称为转化。把重组噬菌体或重组病毒DNA引入受体细胞(菌)叫转染。? 2．感受态?
感受态就是细菌吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。所以要转化成功，首先要使受体菌处于感受态。刺激细菌使之成为感受态的方法很多，如CaCl2处理、电激等。? 3．DNA转化的过程?
受体菌以Ca2+处理，在低温中与外来DNA分子相混合，DNA分子转化的复杂过程包括4步：
(1)吸附—完整的双链DNA分子汲附在受体菌的表面；?
(2)转化—双链DNA分子解链，单链DNA入受体菌，另一链降解；? (3)自稳—外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环装DNA；? (4)表达—供体基因随同复制子同时复制并被转录、转译。? 二、方法 ?
(一)受体菌的培养与CaCl2处理?
1.从固体培养基平板上吊菌接种到2mlLB试管中，37℃振荡培养过夜。? 2.取0.4ml菌液转接到30ml/150ml三角烧瓶中，振荡培养2小时30分钟以上，? 3.取9ml菌液于灭菌有盖离心管4000 r/min离心5分钟，收集菌体。?
4.把菌体悬浮在75mmol/L CaCl2中(约10毫升左右)，冰浴25分钟，4000r/min离心5分钟，收集菌体。?
5.再把菌体悬浮在0.6毫升的75mmol/L冷CaCl2中，使菌液浓缩15倍(9毫升～0.6毫升)，冰上作为转化用的受体菌菌液。? (二)转化反应?
1．在灭菌的1.5ml离心管中加入50μl新鲜制备的DH5α感受态菌及5μl的连接产物，混匀后冰浴30min。
2．将离心管移入42℃水浴中，恰好停留90sec（切忌振荡）。使受体菌极短暂热刺激，以利于DNA的吸收，提高转化效率。
3．立即将离心管置于冰浴中，120sec后再移入37℃水浴中孵育5min。
4．向离心管中加入200μlLB液体培养基，在37℃恒温振荡器上以110r/min培养1h。以利转化后的受体菌，在良好的环境(通气、新鲜的LB液体培养基)中繁殖生长。 (三)涂板?
1?取反应物在平板上涂布。?
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2?涂布菌液的平板置室温下干燥，然后倒置在37℃温箱中培养过夜。? 三、试剂?
75mmol/L CaCl2溶液? 无水氯化钙4.16克? ddH2O 至500毫升? 1.1kg/cm灭菌20min? ?四、材料? 1．菌种? 大肠杆菌 DH5α? 2．培养基? (1)LB液体培养基? LB液体培养基? 精解蛋白胨 3 g? 酵母浸出粉 1.5 g? 氯化钠 3 g? 葡萄糖 0.6 g?
按上述配方用重蒸水(ddH2O或dH2O表示，下同)溶解至300 ml。用10mol/L NaOH调pH至7.2～7.4。分装于15 ml 试管中，每支5ml。然后置高压蒸汽消毒锅以1.1kg/cm灭菌20 min。
(2)LB固体培养基：取500ml三烧瓶，加入? 琼脂 4克? LB液体培养基 200ml? 1.1kg/cm灭菌20分钟? 3．抗菌素? Amp(100mg/ml) 五、仪器? 1．恒温培养箱? 2．恒温振荡器? 3．普通离心机? 六、说明?
1．连接后的DNA溶液与细胞混合后，一定要在冰浴条件下操作。如果温度时高时低，转化率极差。?
2．DNA连接液的盐浓度较高，与细胞混合时要加以稀释，因为高盐浓度会影响转化率。? 3．外源DNA的大小和结构对转化效率有很大影响，一般说来，分子越小，转化效率越高；环形分子的转化效率比线形分子的转化效率要高等于多。共价闭环的超螺旋的质粒DNA比同
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种线形DNA分子的转化效率高上千倍，因此，在转化前要尽量保证重组DNA为完整的环状分子。
4．用于转化的细菌细胞在对数生长期的转化能力最高，静止生长期以后，转化能力逐渐丧失。
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