②离子与活性?
对Mg敏感，Mg浓度适中直激活作用，浓度太高抑制酶活性。? ③核酸外切酶活性?
没有3′→5′酸外切酶活性。?
有依赖于DNA合成作用的，链置换的5′→ 3′核酸外切酶活性。? ④其他：?
适当浓度(50mmol/L)KCl激活50～60%，高于此浓度抑制活性。? ⑤错误率(碱基配对不忠实)?
每80，000碱基对中错一个，25轮循环之后，400个碱基对中错一个，dNTP与Mg增高，错误率加大。? (3)用量：?
反应总体积为100μl时，酶用量为1～2.5U然而，由于DNA的不同和引物不同，以及其他条件的差别，Taq酶用量亦有差异。Taq酶的试验用在0.5～5IU之间，根据电泳结果决定酶的最佳用量。若酶的用量偏高，有非特异性产物出现。若酶的用量偏低，则合成产物量少。 2．模板：?
(1)DNA模板(基因组DNA)? ①样品处理?
血液、血斑、精液、精斑、羊水、口腔上皮细胞 、尿样、毛发、石蜡包埋组织等都可以提取DNA进行PCR。? ②模板量：10～10目的分子?
1μg人基因组DNA单拷贝基因约含3×10目的分子? 10ng酵母细胞约含3×10目的分子? 1ng大肠杆菌细胞约含3×10目的分子? 1/100 M13噬菌斑约含10目的分子? ③模板量与循环次数的关系?
目的分子数 循环次数 3×10 25～30 1．5×10 30～35 1×10 35～40 50 45～50?
若模板来源困难，以合适模板量及最小循环数为宜。? 3．引物的条件：? ①长度?
与模板顺序互补的分应为15～30个核苷酸(NT)常用20NT左右。近年来，由于引物合成
-6-
3
45
6
55
6
5
6
2+
2+
2+
成本的降低，为了增加特异性，引物长度有增加的趋势。? ②跨度?
常扩增2Kb以下的片段，但长片段扩增试剂盒也可扩增10kb以上，有的达数10kb。? ③顺序?
要求特异的顺序。可通过基因数据库检测与相关基因的同源性。? ④碱基?
GC为40～60%，GC太少扩增效果不佳，GC过多易出现非特异性条带，ATGC最好随机 分配，避免成串的嘌呤和嘧啶，任一碱基的百分含量都在10%～40%之间，不出现5个以上同一核苷酸的寡聚体。? ⑤Tm值?
PCR引物的Tm值应为55～80℃。?
对于PCR引物，Tm值计算一般以每个G或C 4℃，每个A或T2℃计算，即：? Tm=4×(G+C)+2×(A+T)? ⑥二级结构?
避免引物内部出现明显的二级结构。 ⑦引物间互补?
一对引物的顺序不应互补，尤其是避免3′端的互补，以免形成引物二聚体。 ⑧引物二端
3′端：3′端的碱基要求严格配对，特别是最末及倒数第二个碱基要求绝对配对。如果不知扩增序列，而是从氨基酸推测DNA的顺序，引物的3′端最好选择只有一个密码子的甲硫氨酸或色氨酸，如果3′端最末的碱基不肯定，可用次黄嘌呤取代，因为次黄嘌呤(Ⅰ)可与ATGC配对，这样可避免因3′末端碱基不配对而造成PCR失败。?
5′端：引物5′端要求不严格，5′可附加一段与模板非互补的序列，可长至45NT，而不影响扩增。? ⑨cDNA引物?
除了上述条件外，还应注意：?
二个引物应跨越一个或二个内含子，或选择二个外显子剪接处的顺序，这样可以避免基因组DNA的污染而影响结果。引物退火时就不五基因组DNA结合，而只与cDNA结合。? (2)引物量?
每条引物的浓度为0.1～1μmol或100pmol～1000pmol转换成μg必须乘以分子量。如0.1μmol 引物转变为μg则为0.1×引物分子量。?
引物的精确分子量可用下列公式计算：?
引物分子量＝An×312.2 + Gn×328.2 + Cn×288.2 + Tn×303.2 – 61（ An、Gn、Cn和Tn分别为A、G、C和T的数量）。?
合成引物时，含量单位常用A260或OD260表示。?
-7-
1A260单位指溶于1ml pH7.0磷酸缓冲液在1.0cm光路中测定260nm的光密度值为1.0的冻干寡聚核苷酸量?
1A260单位单链DNA=33μg? (3)引物应用样品的制备与保存。?
引物可直接溶于水或pH7.0(或溶于接近pH7.0)的缓冲液? 保存：冻干粉－20℃数年? 溶液：－20℃数月? (4)改变引物产生的新型PCR? ①反向PCR?
典型的PCR是对两个已知序列之间DNA片段扩增。然而反向PCR则将位于已知序列两侧的末知序列进行扩增。用适当的限制性内切酶在已知序列外侧目的基因两端切开DNA链，使酶切片段自身连接形成环状分子，从而将外侧区域化为内侧区域，设计与已知序列末端同源引物，并使其3′端朝向未知区域 ，则可以用PCR扩增环中的未知区域。? ②锚定PCR?
如果待扩增的序列只有一端是已知的，别一端是未知的，则可以用锚定PCR进行扩增。例如，要扩增一个感兴趣的mRNA，已知3′端序列，5′端序列不清楚。通过反转录酶将mRNA转录成cDNA,然后在DNA末端转移酶的作用下，在cDNA3'末端加入Poly(dG)尾巴。根据已知一端的特异序列合成第一个引物、带在Poly(dc)尾的“锚顺序”作为第 二个引物，用PCR可扩增出感兴趣的cDNA。? ③不对称PCR?
标准的PCR产生靶序列的双链DNA拷贝。不对称PCR可产生单链DNA。主要方法是在PCR反应中加放不等量的一对引物(比例一般为50∶1或100∶1)，经过若干循环后，其中一种引物消耗完，在随后的循环中，只有一种引物参加反应，结果形成了单链DNA。此方法可用于DNA序列分析和制备单链DNA探针。? ④引物标记PCR?
对PCR引物5′端进行标记，使得PCR扩增产物5′端带有相应的标记物(如荧光素、同位素和生物素等)。用P ATP直接将一个PCR引物磷酸化，然后在标准PCR反应中直接使用标记引物，扩增出一端带有标记的片段。这种末端标记法对产物直接测序，不影响PCR反应。这种方法标记后，可用杂交检测PCR产物。它也可以对PCR产物进行定量。用不同颜色的荧光染料标记寡苷酸引物，同时使2个或2个以上的DNA区段扩增，终止扩增后除去未延伸的引物，用紫外光照射扩增产物，就能显示某一种荧光染料的颜色或几种荧光染料的颜色组合，例如单呈红色或绿色，则说明缺失了其中一个DNA区段，若显示黄色(由红色和绿色互补形成)则说明这两个区段均存在。? ⑤多重PCR?
多重PCR技术就是在一个反应体系中同时混入多对不同的引物，从而扩增出多段PCR产
-8-
32
物。多重PCR是一种实用可靠的检测DNA缺失方法。 ⑥加端PCR?
加端PCR是使扩增产物的末端加上一段DNA顺序的PCR。加端PCR的引物被设计成除与模板配的一部分以外再加上若干碱基这样便能使增产物的末端加上额外的一段DNA。1986年Scharf等利用加端PCR技术在扩增产物末端加上一个限制酶的识别顺序。以后，有人发现引物足够长时扩增产物的末端甚至可加上多至数十个碱基。应用这一方法可以在扩增产物的末端加上特定功能的DNA片段。? ⑦重组PCR?
含两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。分子遗传学研究工作中要求引入的点突变、插入或缺失往往并不处于DNA链的末端，所以加端PCR有它的局限性。1986年Mullis等报道了由PCR扩增的两个DNA分子。这一技术可应用于在DNA片段的任何位置引入位点专一性突变、插入、缺失等以及两个不相邻片段的连接。? 4．dNTP?
四种脱氧核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP的浓度通每种用20～200μmol/L，过高的浓度导致聚合酶将其错误掺入，影响扩增产物；dNTP用量控制在循环50次后，dDNTP仍保留50%，采用等浓度的dNTP可减少误掺入错误，用低浓度的dNTP比用高浓度dNTP有更好的特异性、准确性，dNTP用量与目标序列组成长度有关。值得注意的是dNTP与Mg2+结合影响游离的Mg2+含量、dNTP改变，Mg2+改变。中性的dNTP可直接从试剂公司购得(pharmacia、Sigma、华美)如果购买冷冻干燥的粉剂，可以自配溶液，但自配的溶液必须用NaOH中和，用前用紫外吸收法测定浓度。一般应将dNTP应保存在-20℃? 5．Mg2+??
Mg2+浓度对扩增作用的专一性和扩增量有重大影响，通常最适浓度为1.5mmol/L左右(每种dNTP 200μmol/L)。Mg过高，导致非特异性扩增产物。过低则降低扩增产物量。? 6．循环参数?
各步温度、时间与引物长度及GC含量有关。升、降温度速度快则减少扩增时间，复性效果好。如果变性温度高，则酶活性损失大，变性温度低，则不能全变性，扩增产物产量降低。
退火温度可采用引物Tm-5。?
退火与延伸温度合二为一则成为二温循环PCR，其优点是增加特异性和减少反应时间。7．PCR仪? 8．产物? (1)凝胶电泳分析?
1.5～4%琼脂糖凝胶，分离100～1000bp小片段。? 6～10%聚丙烯酰胺凝胶分离小于100bp片段?
产物回收：用2～3%低融点脂糖糖凝泳分离。加等体积的苯酚、氯仿，65℃溶化，混匀、
-9-
2+
振荡、速冻、高速离心、上清液加NaCl至0.3mmol/L,用两体积无水乙醇沉淀。? (2)特异性的分析? ①大小与预计一致? ②酶切、切点与设计一致? ③探针杂交? ④顺序分析? (3)不出现扩增条带? ①酶失活，调换新酶?
②模板中含有杂质，特别是甲醛固定石蜡包埋的组织，往往常含有甲酸，造成DNA脱嘌呤而 影响PCR结果。?
③模板变性不彻底模板先在沸水浴中加热5分钟，后立即冰浴中速冷。? ④引物变质失效?
⑤反应体积改变为20μl～100μl温度平衡慢。? (4)非特异条带的出现?
①非特异小片段：引物二聚体，引物过量，3′重叠。?
②非特异大片段：引物过量，引物顺序特异性不高，循环次数多，酶质量不好，酶量多。? 改进：降低酶量或调换酶，增加模板量，降低引物量，减少循环次数，提高退火温度，重新设计较长一点的引物。? (5)出现整个涂沫条带?
原因：酶过量，质量差，dNTP过量，循环数过多，退火温度过低MgCl2，浓度过高。? 改进办法：? ①减少酶量，换酶。? ②减少dNTP。?
③增加模板量，减少循环数。? ④改用二温度PCR循环。? ⑤MgCl2过高，降低。? 9．污染问题? (1)污染源：PCR产物?
(2)防止污染措施，PCR反应前后所用试剂、器材分开存放，设计阴性对照。?
-10-