实验六 质粒DNA的提取?
一、原理：?
采用碱变性法抽提质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。在pH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH 5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质—SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
很多生物试剂公司还提供试剂盒用于小量质粒DNA的提取。通常情况下，采用试剂盒都能获得较高质量的DNA，所得到的DNA都可直接用于转染、测序及限制酶分析等。下面介绍二种试剂盒。? 二、方法
方法1(博大泰克B型质粒小样快速提取试剂盒)?
1．挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含pUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基(5ml/15ml试管)中，37℃震摇培养过夜。?
2．将1.5ml菌液加入微离心管中，14 000r/min,离心10s，弃去上清液。反复数次，收集全部菌体。?
3．倾去上清，滤纸吸干。?
4．加100μl 溶液1，震荡起菌体。?
5．加150μl 溶液2，立即轻柔颠倒离心管，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮，然后将离心管防止冰上1-2分钟。?
6．加150μl 溶液3，立即温和点到数次,室温放置5分钟，12000rpm离心12min。 7．将420ul结合缓冲液加入离心吸附柱上，然后将步骤6中的上清加入离心吸附柱中（尽量去除杂质），混匀，12000rpm离心30秒。倒掉废液收集管中废液。
8．加入750ul漂洗液于离心吸附柱，静置1分钟后，12000rpm离心15秒，倒掉废液收集管中废液。重复一次，倒掉废液后，再次于12 000r/min离心2min，尽量除去漂洗缓冲液。 9．小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管中，加入适量的洗脱缓冲液，常规50ul，室温放置2-5分钟，12 000r/min离心1分钟。
方法2（BioFlux Biospin质粒DNA小量提取试剂盒） 1．将1-1.5ml过夜培养的菌液加入1.5ml离心管中。 2．于10 000rpm(8000-10000g)离心30秒，并去处上清。 3．加250ul Resuspension Buffer,重悬细菌沉淀。
4．加250ul细胞Lysis Buffer,轻柔颠倒4-6次。（不要剧烈震动，防止基因组DNA被剪切，注意不要让反应持续超过5分钟）
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5．加350ulNeutralization Buffer，立即轻柔颠倒离心管4-6次。 6．于13000g（大于14000rpm）离心10分钟。
7．将步骤6离心后得到上清转移到Spin column内，于6000g（小于等于6000g）离心1分钟，并弃去接液管中的液体。?
8．向Spin column内加入650ul Wash Buffer，于12000g离心30-60秒，并弃去接液管中的液体。
9．重复第8步一次。
10．再次于12000g离心1分钟，然后将Spin column转移到无菌的1.5ml离心管中。 11.向Spin column内加入50ulElution Buffer、去离子水或TE溶液，并于室温静置1分钟。
12．于12000g离心1分钟，1.5ml离心管溶液中含有质粒。 三、材料? 1?菌种：? 2?培养基? LB液体培养基? 精解蛋白胨 3 g? 酵母浸出粉 1.5 g? 氯化钠 3 g? 葡萄糖 0.6 g?
按上述配方用重蒸水(ddH2O或dH2O表示，下同)溶解至300 ml。用10mol/L NaOH调pH至7.2～7.4。分装于15 ml 试管中，每支5ml。然后置高压蒸汽消毒锅以1.1kg/cm2灭菌20 min。 3．抗菌素：?
氨苄青霉素(Amp)临用时用无菌水配制在无菌有盖试管中，浓度为100 mg/ml。 4. 博大泰克B型质粒小样快速提取试剂盒 5. BioFlux Biospin质粒DNA小量提取试剂盒? 四、仪器：? 1?恒温振荡器。? 2?低温冰箱-20℃。? 3?台式高速离心机。? 五、说明：?
1．质粒DNA提取的方法很多，有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、溴化乙锭----氯化铯梯度超离心法等。本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法也有多种，但基本原理和步骤是一致的，包括下述步骤：(1)裂解菌体细胞；(2)质粒和染色体DNA的分离；(3)除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分；(4)除去提取过程中使用的去垢剂、盐
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等。
2．在基因操作实验中，保存或提取DNA过程中，一般都采用TE缓冲液，而不选用其它的缓冲液。虽然很多缓冲系统，如磷酸盐缓冲系统，硼酸系统都符合细胞内环境的生理范围，可以作为DNA的保存液，但在某些实验中，这些缓冲液对会影响实验。如在转化实验中，要用到Ca2+,如果用磷酸盐缓冲液，磷酸根将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀；在各种工具酶反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl缓冲系统，不存在金属离子的干扰作用；TE中的EDTA是二价离子Mg2+、Ca2+等的螯合剂，可降低系统中的这些离子浓度，而这些离子是脱氧核糖核酸酶的辅助因子，所以EDTA可以抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用。?
3．NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中稳定，但当pH大于12或小于3时，就会引起DNA两条链之间氢键的解离而变性。TENS中有NaOH使其pH大于12，因而使染色体DNA与质粒DNA变性。?
4．SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：(1)溶解细胞膜上的脂肪与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；(2)解聚细胞中的核蛋白；(3)SDS能与蛋白质结合成复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去干净，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受干扰。?
5．3.0mol/L NaAC(pH5.2)使pH大于12的DNA抽提液回到中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。染色体DNA不能复性(染色体DNA不存在超螺旋共价闭合环结构)。而高盐的3mol/L NaAC有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀。pH5.2也能中和核酸上的电荷，减少相互斥力而互相聚合。同时，钠盐能与SDS-蛋白质复合物作用后，形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。? 6．关于无水乙醇沉淀DNA的说明：?
用无水乙醇沉淀DNA，是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是具有极性，可以以任意比例和水相混溶，乙醇与核酸不会起化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。
乙醇之所以能沉淀DNA，是由于DNA溶液是以水合状态稳定存在的DNA，当加入乙醇，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合沉淀。一般实验中，用2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，使乙醇的最终含量占67%左右。由此可预见，也可用95%乙醇沉淀DNA，但是用95%乙醇使总体积增大，而DNA在醇溶液中总有一定程度的溶解。因而DNA损失也增大，影响收率。?
乙醇沉淀DNA溶液时，DNA溶液中应该有一定的盐浓度，中和DNA表面电荷。如果溶液中盐浓度太低，要加NaAC或NaCl至最终浓度0.1～0.25mol/L。在pH 8左右的DNA溶液中，DNA分子带负电荷，加一定浓度的NaAC或NaCl,使Na?+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全。但当加入的盐溶
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液浓度太高时，其效果也不好，在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须进行洗涤或重沉淀。?
乙醇沉淀DNA，一般采用低温条件，这是由于在低温条件下，分子运动大大减少，DNA易于聚合而沉淀。为了使质粒DNA能充分沉淀，一般保存时间总是过长的，同时也要视样品的体积而异，在微量离心管中的样品要比40毫升离心管中DNA样品的量少，冷却就较迅速。 除了用乙醇外还可用1倍体积丙醇(相当于2倍体积乙醇)使DNA沉淀。用异丙醇的好处是要求离心的液体体积小，但异丙醇挥发性不如乙醇，最终除去其残留部分的难度更大。此外，异丙醇能促使蔗糖、氯化钠等溶质与DNA一起沉淀，在-70℃时更容易发生，所以一般以乙醇沉淀为宜，除非要求液体体积很小。? 7．影响质粒DNA提纯质量和产率因素的说明。? (1)菌株?
质粒的宿主菌菌株的不同对质粒DNA纯化的质量和产率很大。一般最好选用enA基因突变的宿主菌，如DH5α，JM109和XL1-Blue等。使用含野生型enA基因的菌株会影响质粒DNA的纯度。?
enA基因是核酸内切酶Ⅰ。核酸内切酶Ⅰ是一种12kDa的壁膜蛋白，受镁离子激活，可被EDTA抑制，对热敏感。双链DNA是核酸内切酶Ⅰ的底物，但RNA是该酶的竞争性抑制剂，能改变酶的特异性，使其由水解产生7个碱基的寡聚核苷酸的双链DNA内切酶活性，变为平均每底物每次切割一次的切口酶活性。核酸内切酶Ⅰ的功能仍不清楚，enA基因突变的菌株没有明显的表型改变，但质粒产量及稳定性明显提高。细菌不同生长期核酸内切酶Ⅰ的表达水平不同。生长的指数期较稳定期核酸内切酶Ⅰ水平高300倍。此外，培养基中促进快速生长的成分如高葡萄糖水及补充氨基酸都会使核酸内切酶Ⅰ水平增高。?
此外，菌株的其他性质有时也应加以考虑。如XL1-Blue生长速度较慢。HB101及其衍生菌株如TG1及JM100序列，含大量的糖，这些糖如果在质粒纯化过程中不除去，在菌体裂解后释放出来，可能抑制酶活性。? (2)质粒的拷贝数?
细菌中质粒的拷贝数是影响质粒产量的最主要的因素。质粒的拷贝数主要由复制起点(replication origin)如pMB1及pSC101及其附近的DNA序列决定。这些被称作复制点的区域通过细菌的酶复合物控制质粒DNA的复制。当插进一些特殊的载体时，能降低质粒的拷贝数。此外，太大的DNA插入也能使质粒拷贝数下降。一些质粒，如pUC序列，由于经过了突变和改造，在细菌细胞内的拷贝数很大，以pBR322质粒为基础的质粒拷贝数较低，粘粒(cosmid)及特别大的质粒通常拷贝数极低。 (3)细菌培养?
用于制备质粒的细菌培养应该从选择性培养的平板中挑取单个菌落培养。不应该直接从甘油保存菌，半固体培养基及液体培养基中挑菌，这可能导致质粒丢失。也不该从长期保存的平板上直接挑菌，这也可能使质粒突变或使质粒丢失。挑取单个菌落至3ml选择性培养基
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中，培养至饱和状态(12～14小时)就可进行小量质粒提取。?
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