生产产地 上海医疗器械第七厂 （4）电热恒温鼓风干燥箱
产品型号 DHG-9032A
生产产地 上海精宏设备有限公司 （5）漩涡混合器 产品型号 XW-80A
生产产地 上海青浦泸西实验仪器厂 （6）血清VEGF水平检测盒
生产产地 美国R&D生物医学公司 （7）ELISA试剂盒
生产产地 上海西唐生物科技有限公司 2.3测定方法：
2.3.1 血清TNF-α水平检测原理[33]：
本试验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人TNF-α单抗包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，人TNF-α会与单抗结合，其他游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人TNF-α抗体，抗人TNF-α抗体与TNF-α结合，然后就形成双层夹心的免疫复合物，其他游离的成分通过彻底的洗涤过程被除去。随后加入以辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素与亲和特异性相结合，亲和素连接的酶会与夹心的免疫复合物进行连接。其他游离的成分通过彻底的洗涤的过程被除去。最后加入显色剂若样本中存在TNF-α将会形成免疫复合物，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色
变深，在492nmOD值，人TNF-α浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中人TNF-α浓度。 2.3.2 血清VEGF水平检测原理[34]：
本试验采用双抗体夹心ELISA法。用抗人VEGF单抗包被于标板上，检测相抗体为多克隆抗体，经生物素标记。先将样品加入酶标板孔，然后将物素标记抗体加入酶标板孔使其进行反应，两抗体与酶标板孔的标准样品中的VEGF形成“抗体-VEGF-抗体”，游离的成分通过彻底洗涤的过程被除去。随后加入过氧化物酶标记的亲和素并使其反应反应；生物素与亲和特异性物质相结合，经PBS彻底洗涤后用底物TMB染色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下最终转化成黄色。颜色的深浅和样品中人的VEGF含量呈正相关。在450nm测定OD值，并利用绘制标准曲线求出标本中VEGF的浓度。
2.4 血清TNF-α和VEGF水平测定步骤[35,36]： 2.4.1血清TNF-α水平测定步骤：
（1）首先在室温下解冻待测血清样品并按照说明书配置各种所需制剂。
（2）从已平衡到室温的密封袋中取出所需数量的板条，设立标准孔。空白孔及待测品孔。
（3）向标准孔内滴加标准品，做倍比稀释。
（4）建立标准曲线：TNF-α的终浓度梯度为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、0pg/ml。
（5）将待测样品100ul滴入待测品孔中，于37℃将反应板置呈水平位静置120分钟。
（6）反复洗涤反应板5次，在滤纸上印干，每孔中加入第一抗体工作液100ul，充分混匀后置于37℃并静置60分钟。
（7）再次用洗涤液将反应板充分洗涤5次，在滤纸上印干后，每孔中加入底物工作液100ul，于37℃60分钟静置存放。
（8）再次洗涤反应板，每孔中加入100ul底物工作液，至于37℃暗处反应10分钟。
（9）每孔中加入100ul种植液混匀，在492nm处测量吸光值。 （10）利用酶标仪的测量值绘制标准曲线，通过图形拟合计算各待测样品的含量。
2.4.2血清VEGF水平测定步骤：
（1）标准品液配制：将标准品于1ml蒸馏水混匀，配成溶液8000pg/ml。设标准管8管，每管加入标本稀释液500ul。在第一管中加入标准品溶液500ul混匀后用加样器吸出500u滴入第二管。如此反复做对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。 （2）标本稀释液：用蒸馏水按照1:10稀释。 （3）洗涤液：用重蒸水按照1:10稀释
（4）加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反映板混匀后置
于37℃静置120分钟。
（5）洗板：充分洗板5次，在滤纸上彻底印干。
（6）每孔加入100ul第一份抗体工作液。将反应板混合均匀后置于37℃静置60分钟。
（7）洗板：充分洗板5次，在滤纸上彻底印干。
（8）每孔中加入100ul酶标抗体工作液。将反应板置于37℃静置30分钟。
（9）充分洗板5次，在滤纸上彻底印干。
（10）每孔中加入100ul底物工作液，置于37℃暗处反应25分钟。 （11）每孔中加入100ul终止液混匀。
（12）30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。 2.5结果计算：
2.5.1血清TNF-α水平的结果计算：
（1）将所有OD值均减去空白值，再做计算。
（2）标准品使用一下浓度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、0pg/ml，其OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线。见图1。 （3）根据样品的OD值在标准曲线上读出相应人TNF-α含量。
2.5.2血清VEGF水平的结果计算：
(1)选取所有OD值减除空白值后，进行计算。
(2)绘制标准曲线，以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标平滑线连接各标准品的坐标点，在坐标纸上规范作图，描绘出出标准曲线。 (3)根据样品OD的具体取值在标准曲线图上找出相应样品含量，如有稀释的样品需要将所得结果乘上稀释倍数。 2.6. 统计学处理：
将所有数据资料输入计算机，统计学分析采用SPSS13.0软件执行。结果呈正态分布，以平均值+标准差（X+S）表示，统计结果以P＜0.05代表差异具有统计学意义。临床资料数各数据间以方差分析检验，有关指标间以直线相关分析。