第一部分 介绍
1.0手册的介绍
这本手册分五大部分。第一部分对手册进行了介绍。第二部分介绍了样品预处理的方法。第三部分细叙了进行双向电泳第一向电泳的过程。第四部分介绍了利用IPG胶条进行第二向电泳的一般方法。第五部分讨论了双向电泳的显影和结果分析。在这里，使用Amersham pharmacia Bioteeh公司的产品进行双向电泳介绍，设备的选择我们在1、2节中介绍。
1.1 双向电泳的介绍
双向电泳是分析从细胞、组织或其它生物样品中提取出来的蛋白混合物最有力和广泛运用的方法。这项技术利用蛋白质在两次独立的分离步骤中的特性将蛋白质分开：第一向步骤——等电聚焦（IEF）根据蛋白质的等电点（PI）将蛋白质分离。在第二向步骤中SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）利用蛋白质的分子量（MW）大小将它们分离。二向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
双向电泳在1975年由P.H.OFarrel[1]和J.Klose[2]提出，在早先的技术中，第一向分离在含有载体两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶载体中进行，这种胶在狭窄的试管中灌注而成。样品放入管胶的某一端，并且在很高的电压下将它们分开。在完成等电聚焦（IEF）以后，凝胶棒从管子中取出来，在SDS样品缓冲液中平衡。随后，放在垂直SDS—聚丙烯酰胺凝胶上，进行第二向分离。
自从双向电泳被被提出以来，双向电泳作为生化分离技术的重要性事实上早已被承认。但是，它是在最近几年被广泛应用的，由于在各方面的改进。
■ 2—D技术被改进而产生了2—D的图象，这在分辨率和重复性上有很
大提高。这项新技术是由A.Gorg和他的同事发明的。在2—D技术中，使第一向电泳得到了改进，利用固定的pH梯度代替了载体两性电解质产生的pH梯度，并且用塑料胶片支撑的凝胶条代替了柱状凝胶。在章节3.1“Background to IEF”中阐述了这种技术的优越性。
■ 快速分析蛋白的方法被改进了，从而，单个的从2D—凝胶中分离的斑
点能被很快鉴定出来。质量分光光度技术的发展能分析相当少量的蛋白质和多肽。化学微序列和氨基酸分析方法能在改良过的更少样品中使用。利用大量的有价值的抗体，免疫化学鉴定成为可能。
■ 现在可以购得更可靠的低价位的计算机及软件，从而可以用常规的方
法来对双向电泳复杂的图像进行计算评估。
■ 现在可以得到一些生物体的整个基因组，从而可以迅速地断定编码双
向电泳分离的蛋白的基因。
■ 用来与双向电泳结果进行比较的点图像数据库直接可以方便地从Intel
网上得到，并且还可以得到用来指定分离蛋白基因序列的基因组序列
数据库。
双向电泳技术在蛋白组型分析中广泛运用。分析包括对来自同一样品的蛋白质同时进行系统的分离、判定和定量。双向电泳在这方面的运用是由于它能对上千种蛋白进行分离的能力。双向电泳在鉴定后期修饰及共翻译性修饰的能力是独一无二的，这些修饰在基因组序列中不能被预测到。
双向电泳在其它方面的运用包括，细胞差异性分析、疾病标记检测、药物研究、癌研究、纯度分析以及微量蛋白纯化。
本手册对使用从Amersham Pharmacia Biotech公司购得的预制IPG胶条进行双向电泳的方法进行了描述。双向电泳的开始步骤是样品预处理。适当的样品预处理方法对得到好的双向电泳结果相当重要。双向电泳下一个步骤是IPG胶条的重新水化。购得的IPG胶条是干的，在等点聚焦（IEF）之前必须将IPG胶条在含有合适的试剂的溶液中进行水化。第一向等点聚焦是在有温度控制及高电压的条件下的平板电泳仪上进行的。接下来，为了进行第二向的分离，IPG胶条在含有SDS的缓冲液中进行平衡。平衡后，将IPG胶条放在第二向凝胶上进行电泳。最后的步骤是进行显影及对双向电泳点阵结果进行分析。
表1.双向电泳的仪器选择
第一向等点聚焦（IEF）的仪器选择
MultiphorTMII 电泳仪及ImmobilineTM 干胶设备
在膨化托盘中进行重新水化 使用固相干胶设备在MultiphorTMII电泳仪进行等点聚焦 选择因素：
■MultiphorTMII 电泳仪既可以进行第一向也可以进行第二向分离。 ■MultiphorTMII 电泳仪是多功能的，对利用IPG胶条进行等电聚焦没有限制。其它的电泳技术也可以在这台仪器上进行。
图1.MultiphorTMII 电泳仪及
ImmobilineTM 干胶设备
IPGphorTM等点聚焦系统
重新水化和等电聚焦同时能在IPGphor 胶条支撑槽中进行
选择因素
在没有人看管条件下，重新水化过程和等点聚焦可 以在晚上进行。
对IPG胶条的操作很少，减少了错误的机会。 由于电泳时电压很高，因此分离速度和效果很好。 电源的供应和温度控制都组建在设备内。
图2. IPGphorTM等点聚焦系统
表1.第二向SDS—PAGE电泳设备的选择
Multiphor II（平板系统）
24.5×11cm或24.5×18cm凝胶
选择因素
■提供了预制的凝胶：ExcelGel8-18%(24.5×11cm), ExcelGelXL(24.5×18cm)
■ 相当快的速度：电泳时间小于4小时。 ■ 分辨率高。
■ 可以使用所有类型的IPG胶条。
图3. Multiphor II（平板系统）
TM
Hoefer
TM
miniVE或SE260(mini vertical) 8×9cm凝胶
选择因素
■ 电泳速度非常快：1—2小时 ■ 用7cm IPG胶条进行电泳效果最好。
图4. HoeferTM miniVE
HoferTM SE600 (标准垂直型)14
（或16）×15cm凝胶
选择因素
■ 电泳时间4—5小时。
■ 分离的效果中等（15cm长的凝胶）。 ■ 能容纳胶的数量中等。（最多达4块胶）。 ■ 用13cm的IPG胶条进行电泳效果最好。
图5. Hoefer SE 600
Hofer
TM
DALT(大型垂直型) 24×19cm 凝胶
选择因素
■ 电泳需要7小时，一般可在晚上进行。 ■ 分辨率极高（19cm长的凝胶）。 ■ 蛋白质加样量大。
■ 能容纳胶的数量大。（能同时进行10块胶电泳）
图6. Hoefer DALT