表4 柔和破碎细胞的方法
细胞破碎的方法
渗透溶解
这是一种非常柔和的方法，非常适用于被溶解样品降解成小细胞成分。
冻熔法
许多种类的细胞通过对其进行一次或反复地快速冻结随后化冻的方法来降解。 去污剂溶解法
去污剂能溶解细胞的细胞膜从而降解细胞并释放内含物。
适用材料
血细胞
组织培养细胞
细菌细胞 组织培养细胞
组织培养细胞
一般过程
将细胞悬浮在低渗透液中。
利用液氮将细胞迅速冻结后迅速化冻。如果需要，可反复进行。
将细胞悬浮在含有去污剂的裂解液中。
细胞往往可以直接在样品溶液或重新水化液中裂解，因为它们含有去污剂。参照附录（溶液A），提供了常用的裂解液的配方。如果使用了诸如SDS这样的离子型去污剂，为了确保不干扰IEF，可以选择以下的步骤之一：
■ 将裂解的样品在含有过
量的非离子或两性去污剂的溶液中稀释。
■ 利用丙酮沉淀法,使SDS
从样品中除去。（参表7，8和2.5 ）
在等渗透液溶液中用酶处理细胞。
酶溶解法
带有细胞壁的细胞可以用酶降解法除去细胞壁。这种方法的进行要有一种能降解被降解细胞的细胞壁的酶。
植物组织 细菌细胞 真菌细胞
当只有一种特定的亚细胞成分（细胞内成分）要分析时，也可以用柔和的破碎方法。例如，选择反应的条件，只释放细胞质蛋白，或那些未接触的线粒体或其他的细胞器通过差速离心的方法也可取得。有时这些方法混合使用。 2..1.2 剧烈的破碎方法
表5中列出了剧烈的破碎方法，当细胞不太容易破碎时可以利用这些方法来
破碎，如硬组织中的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞。剧烈的破碎法能彻底的破碎细胞，但是要避免在此过程中产生热量和泡沫。
表5：剧烈破碎法
细胞破碎方法
适用材料 一般步骤
短时间冲击细胞悬浮液避免产生热量，在超声波冲击过程中将样品放在冰上制冷
超声波破碎法 细胞悬浮液 通过超声波发生器产生的超声波的剪切力将细胞破碎。当达到最大的振幅时，剪切也越完全，但必须注意减少热量的产生和泡沫的形成。 法式压破细胞
在高压情况下通过小孔对细胞施加压力产生的剪切力破碎细胞。 研磨法
一些类型细胞将它们放在研钵中利用碾槌手工能将它们打开。 机械粉碎法
许多设备能用来进行组织的机械粉碎。手工操作的粉碎机（如 Dounce或Polfer-Elvehjem）能够用来破碎细胞悬浮液或相当柔软的组织。 搅拌器或其它的电带动的设备能用来处理大的样品，样品粉碎很迅速并且对蛋白质很安全，除了在粉碎过程中一些蛋白酶的释放。 滚珠粉碎法
旋转玻璃球的摩擦作用能破坏细胞壁，并释放细胞的内含物。
带细胞壁的微生物
将细胞悬浮液放入预冷的法式压力室中，施加压力并收集被挤出的破碎样品。
组织和细胞用液氮冷冻，并将它们反复研磨成精细的粉末，加入石英和细沙有助于研磨。 如果需要，将组织切成薄片加入粉碎缓冲液(组织的3-5倍)，迅速进行粉碎。利用过滤器或离心的方法将粉碎物澄清。
固体组织 微生物 固体组织
细胞悬浮液 微生物
将细胞悬浮在等体积预冷的破碎液中，并转移到一支坚硬的试管内。每克湿细胞中加入1-3克预冷的玻璃珠，旋转液体一分钟并且在冰上冷却一分钟，这样重复2-4次。
2.2 防止蛋白质水解
当细胞被破碎后，蛋白水解酶就被释放出来或被激活。在蛋白质变性过程中，
伴随着蛋白水解作用，使双向电泳最后结果复杂化，因此，必须采用一些方法来避免这些问题。如果有可能的话，直接将样品在强浓度的变性液中变性（8M尿素、10%TCA、或2%SDS）来抑制蛋白酶。在低温的时候，蛋白酶的活性低，因此，建议在样品预处理时尽可能地在低温下进行。此外，许多蛋白酶在pH 9以上就失活了，因此，Tris-碱、碳酸钠或含碱基团的载体两性电解质存在的条件下往往能抑制蛋白水解。
单独使用这些方法来抑制蛋白水解已足够了，然而有些蛋白酶甚至在这些条
件下仍然保持着活性，在这种情况下应当使用蛋白酶抑制剂。每一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用，因此，建议复合使用蛋白酶抑制剂，在商界能得到很多种类的蛋白酶抑制剂。表6提供了常用的抑制剂及抑制的蛋白酶。请参照［12，28，36-40］获得关于蛋白酶抑制的更多方面知识。
表6蛋白酶抑制剂
蛋白酶抑制剂
PMSF
相当常用的抑制剂，使用浓度为1mmol/l。
有效的抑制的酶
PMSF是不可逆抑制剂，能抑制：
■ 丝氨酸水解酶。
■ 一些半胱氨酸水解酶。
使用范围
PMSF在含水溶液中很快失活，在使用前现配。
PMSF在含有巯醇类试剂（DTT或2-去巯基乙醇）时效果不好。这种缺点可以克服，通过将样品在含有PMSF缺少巯基醇类的去污剂溶液中破碎。含巯基类去污剂可以在最后步骤加入。PMSF毒性相当大。
AEBSF具有修饰能力，能潜在改变一种蛋白的PI值。
AEBSF
使用浓度为4mmol/l。
AEBSF在抑制行为上与PMSF相仿,但它更易溶于水并且毒性低。
1mM EDTA,1mM EGTA 这些混合物能抑制金属蛋通常在1mmol/l浓度使用。 白，通过螯合蛋白酶维持
活性所必需的金属离子。 多肽水解蛋白酶抑制剂 这些抑制剂是： ■ 不可逆抑制剂。
■ 在有DTT存在下起活性。
■ 在不同条件下低浓度进行反应。
使用浓度2-20μg/ml。 TLCK,TPCK
(对甲苯磺酰基赖氨酸氯甲基酮,苯磺酰基赖氨酸氯甲基酮)
使用浓度0.1-0.5mmol/l。 Benzamidine
使用浓度1-3mmol/l。
亮抑蛋白酶（Leupeptin）能抑制许多种类的丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶。
抑胃酶（Pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶。
Aprotinin能抑制许多丝氨酸蛋白酶。
苯丁抑制剂（Bestatin）能抑制氨基酸多肽酶。 这两种相近的化合物不可逆地抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶。
多肽蛋白酶抑制剂价格昂贵。 多肽蛋白酶抑制剂是小分子多肽，因此有可能在双向电泳结果中出现，根据其分子大小范围被第二向凝胶分离。
抑胃酶（Pepstatin）在PH为9时不能起抑制作用。
Benzamidine抑制丝氨酸蛋 白酶。
表7 沉淀过程（程序） 沉淀方法 一般程序 硫酸氨沉淀法
在存在高浓度盐时，蛋白质有可能结合起来并从溶液中沉淀出来，许多种潜在的污染物（核酸）将会遗留在溶液中。 TCA沉淀
TCA是一种相当有效的蛋白质沉淀剂。
在含有EDTA的缓冲液中（>50mM）处理蛋白质，最终蛋白浓度大于1mg/ml。慢慢地将硫酸铵加入，至饱和液中并且搅拌10-30分钟，利用离心将蛋白质分离。
在浓缩液中加入TCA，使之最终浓度为10-20%，并且在冰浴中沉淀30分钟。也可以将组织直接在10-20%的TCA中粉碎，这种方法可以限制蛋白质水解和其他蛋白修饰作用，离心并用丙酮或乙醇洗去残留的TCA。
在浓缩液中加入3倍体积的预冷丙酮，使蛋白质在-20℃条件下沉淀2小时。用离心法收集蛋白质，通过空气干燥法或冷冻干燥除去残留的丙酮。
将破碎或破解完的样品悬在含有20mmol/lDTT或0.07%巯基乙醇的10%TCA溶液中。在-20℃条件下沉淀蛋白质45分钟，用离心方法收集蛋白，并且用含有0.07%巯基乙醇或20mmol/lDTT的预冷丙酮溶液清洗。通过空气干燥法或冷冻干燥除去残留的丙酮。
样品中的蛋白能被抽提进入水或缓冲液饱和酚溶液中，在酚阶段利用含有0.1mol/l的乙酸胺的甲醇溶液沉淀蛋白质，用含有乙酸氨的甲醇溶液清洗沉淀几次，然后用丙酮清洗，将残留的丙酮蒸发掉。
使用范围
许多的蛋白质仍然留在高盐浓度的溶液中，若想得到所有蛋白质，这种方法不可取。然而它可以用来进行预分离和蛋白质富集。残留的硫酸铵能影响等电聚焦，因此，必须除去有关盐离子，参照2，4节的方法。 蛋白质可能很难再溶或完全不能再溶。用丙酮或乙醇将残留的TCA充分洗净。
长时间地将样品暴露于这种低pH值溶液中，能引起蛋白质降解和修饰。
丙酮沉淀法
这种有机溶剂常用来沉淀蛋白质。许多有机溶剂污染物（去污剂，酯类）残留在溶液中。 丙酮、TCA沉淀蛋白 在双向电泳样品预处理过程中 ，往往用TCA和丙酮的混合物来沉淀蛋白，这种方法比单独使用TCA或丙酮效果好。
蛋白质可能很难重新溶解或完全不能重溶。
长时间地将样品处于这种低pH值的溶液中能使一些蛋白变性或修饰。
乙酸胺、甲醇溶液沉淀蛋白质并且用酚抽提
这种方法在处理含有高水平的干扰物质的植物样品中被证明是有用的。
这种方法很复杂并很费时。
2.3 蛋白质沉淀过程
进行双向电泳过程中，蛋白质沉淀是任选的步骤。蛋白质沉淀被用来从污染杂质（如盐，去污剂，核酸，酯等）中有选择性地分离蛋白质，这些污染杂质否则能影响双向电泳的结果，此后再将沉淀物溶在样品液中。这种方法也能从稀浓度来源液（植物组织，尿）中浓缩样品。没有一种沉淀方法是十全十美的，有时一些蛋白质沉淀后不能在随后的样品再溶中溶解。因此，在样品预处理中使用沉淀方法有可能改变样品蛋白的成分。如果双向电泳想要完全和精确地得到样品中的蛋白质，避免使用沉淀和复溶的方法。表7列出了一些可用的沉淀方法。若在样品处理中要使用蛋白质沉淀方法，一般只用一种沉淀方法。参考［14，15。41］来获得更多的蛋白沉淀方法。
2.4 除去影响双向电泳结果的污染物
在样品中的非蛋白杂质能够影响蛋白质分离和随后的双向电泳结果的显影。
因此，样品预处理时可包含几步来除去这些杂质。表8列出了影响双向电泳结果的物质以及除去的方法。参考资料［12］给出了对去除干扰物质的进一步探讨。