（4）在IPG胶条上铺上一层IPG覆盖夜（IPG Cover Fluid）用1.5-3ml 的IPG覆盖液，覆盖在每一条IPG胶条上，减少蒸发和尿素结晶。 （5）使IPG胶条重新水化
盖上盖子使IPG胶条在室温重新水化。进行水化至少用10小时，建议在晚上进行重新水化。若IPG胶条膨胀不均匀，请参照表11。 （6）准备固向干胶条设备。（ImmobilueＤryStrip Kit） 在IPG胶条从膨化托盘上移去前，根据3.5.2A和3.5.2B节中所述，准备Multiphor Ⅱ固向干胶条设备和电极胶条（Electrode Strips）。
表11在膨化托盘上进行IPG胶条重新水化故障及排除方法
症状（Symptom） 胶条膨胀不均匀
可能原因（PossibieＣause） 排除方法（Remendy） 注意：往往碱性端比酸性端膨化速度快。
失水的IPG胶条在室温或在高于室温的条件下储藏太久。
重新水化液的使用体积不正确。
重新水化时间太短。
不要让干燥的IPG胶条在室温下存留时间超过10分钟胶条会从空气中吸收水分，将IPG胶条密封好在-20℃以下温度保存。
搞清楚加入到膨化托盘上的槽中的正确溶液体积。 重新水化时间至少需要10小时。
3.5.2等电聚焦准备（IEF）
双向电泳固向干胶条设备的组成包括：一个托盘和电极支撑架，正和负电极，一个干胶条对准器，一把样品杯栅和样品杯。
在IPG胶条从膨化托盘移走前以下步骤A和B必须预先完成。 A．固相干胶条设备的准备
（1） 清洗所在的固相干胶条设备及附件。
固相干胶托盘，干胶对准器，电极，样品杯栅和样品杯，应当清洗干净备用，用去污剂清洗，并且用大量蒸馏水冲洗，然后干燥。 （2） 在MultiphorⅡ上检查电源连接。
检查在MultiphorⅡ设备上红色的连接线连接。 （3） 安装冷却装置
在Multi Temp Ⅲ静热循环仪上设置温度为20℃将冷却盘安置到Multiphov Ⅱ设备上，并确保表面是否水平。打开MultitempⅢ静热循环仪。 （4） 安装固相干胶托盘
用吸管吸取10ml左右的IPG覆盖夜到冷却盘上。将固相干胶托盘安装在冷却盘上，这样使托盘红色连接口位于冷却盘顶部的冷却管附近。除去托盘和冷却盘之间的大气泡，小气泡可以被忽略。IPG覆盖液在这里能使冷却盘和托盘之间接触良好，将红色和黑色电极插入到MultiphovⅡ设备的托盘上。 （5） 安装干胶对准仪
将15ml的IPG覆盖液倒入固相干胶托盘上。将干胶对准仪放入到托盘中，位于IPG覆盖夜上，使具有13条沟槽的一侧朝下。在干胶对准器下，胶条位置之间的气泡不会影响实验。在这时避免使IPG覆盖夜粘在对准仪上，这样会干扰各槽的显影。
B．准备电极条
（1） 将电极条切成一定规格
将两根IEF电极条切成110mm长度。 （2） 用蒸馏水将电极条湿润
将电极条放在干净的表面如玻璃皿，用0.5ml的蒸馏水使各电极胶条湿润。用滤纸将胶条的水吸去。
注意：电极胶条必须保持润湿而不是湿透水。过量的水能产生条纹。 注意：A 和B步骤必须在等电聚焦前完成。
C．电泳的准备
（1） 将水化后的IPG胶条从膨化托盘上移去
为了从膨化托盘槽中移去IPG胶条，沿着槽的倾斜一端划动镊子的尖端，并且使镊子尖端在IPG胶条下稍微向下压。用镊子夹住胶条的一端，并提起来，从托盘中拿出。 （2） 用去离子水冲洗IPG胶条
用镊子夹住IPG胶条，用去离子水流轻轻地快速冲洗IPG胶条。冲洗胶条为了除去胶条表面多余的重水化液，这样在等电聚焦过程中，可以防止在胶表面出现尿素晶体。将IPG胶条的一边放在潮湿的滤纸上几秒钟，从而吸去多余的水分，避免使凝胶的表面与滤纸接触。 （3） 在干胶对准仪（Drystrip ahgner）中安置IPG胶条
立即将水化后的IPG胶条转入到干胶托盘上的对准仪的相邻沟槽中，使胶条的成尖端（酸性）位于托盘上端接近红色的电极处。钝的一端应当位于托盘的另一端，接近阴极端。对准IPG胶条，使阳极的凝胶边缘成一条线。
（4） 安置电极条
安置潮湿的电极胶条，使胶条横贯已对准胶条的阳极和阳极两端，电极胶必须至少与各IPG胶条的表面部分接触。 （5） 安装电极（图12）
每个电极在边上标有红色（正极）或黑色（负极），在电极胶条上调准各电极，确保标注边与在托盘上给定电极接口的边对应。当电极正确调整后，向下压低电极，使电极与电极条接触，检查
IPG胶条依然在各自的沟槽中对齐。
D．任选：凝胶重水化后加样
若样品在胶条重水过程中没加样，在进行电泳前，可以利用样品杯进行加样，当使用样品杯时，加样的量就少了，并且，更具限定性。不同梯度和胶条的合适的加样量，在表12中给定。这些数据只能作为一般的参考，根据样品和所使用的染色方法的灵敏性，合适的加样量将会有很大的不同。 （1） 准备样品
在与使用的重新水化液具有相同成分溶液中准备样品。
表12用样品杯加样的合适样品量 固相干胶条（immobiline Drysfrip） 7cm 7cm 7cm 11cm 11cm 11cm 13cm 13cm 13cm 18cm 18cm 18cm 24cm 24cm 24cm
pH 4-7 pH 6-11L
pH 3-10L PH3-10NL pH 4-7L pH 6-11L pH 3-10L pH 4-7L pH 6-11L
pH 3-10L PH3-10NL pH 4-7L pH 6-11L
pH 3-10L PH 3-10NL pH 4-7,3-7 pH 6-9,窄pH梯度 pH 3-10,3-10NL
合适加样量（ug蛋白质） 4-8(银染) 20-120(考染) 8-16 40-240 2-4 10-60 10-20 50-300 20-40 100-600 4-8 20-120 15-30 75-450 30-60 150-900 8-15 40-240 30-60 150-900 60-120 300-1500 15-30 75-450 45-49 200-1300 80-170 400-2000 20-40 100-600
（2） 确定加样点
最佳的加样点依赖于样品的特性，当感兴趣的蛋白质具有偏酸性的PI值或在样品预处理过程中使用了SDS，建议在接近阴极处设立加样点。带正电的样品进行加样需要PH6-11的梯度，最好使用PH3—10的梯度。由于样品的自然属性不同，最佳的加样点也可能各不相同。经验性的确定加样点位置是相当重要的。 （3） 安置样品杯栅
将样品杯放置在样品杯栅上，放在样品杯栅足够高的位置以避免接触凝胶表面。依据你的样品，调整样品杯栅的位置，使样品杯离阴极或阳极几毫米远。样品杯必须面对着电极。样品杯栅的一边具有一块垫片。向阳极或阴极移动样品杯栅，直至垫片正好接触阴极或阳极。
（4） 正对IPG胶条下压样品杯
移动样品杯至指定位置，使各IPG胶带上方各具一个样品杯，并且下压样品杯，使样品杯与胶条接触良好。这可能是所有过程中最关键的一步。检查胶条是否位于正确位置，在干胶对准仪上成一直线。
（5） 加入IPG覆盖液
当样品杯正确安装完后，在托盘上倾入70-80ml的IPG覆盖液，使胶条完全被覆盖液覆盖。若IPG覆盖液渗透到样品杯内，调准样品杯的位置，吸管吸去杯内的覆盖液，并检查是否依然渗透。加入大约150ml的额外 IPG覆盖液，使样品杯覆盖。IPG胶条沉没在一层IPG覆盖液下，可以防止IPG胶条变干，防止重水化液成份的沉淀，并且还可以防止空气溶入IPG胶条。 （6） 加样（图14）
利用微量移液器在IPG覆盖液面下加样（每条IPG胶条可加多达100μl的样品）样品应当沉入样品杯的底部，观察样品是否从样品杯中渗出来。
注意：正如在3.3节所提到的，当样品通过样品杯加样时，在加样点上有可能形成沉淀，这样加入量的蛋白质数量有可能比在重水化液中加量的蛋白质数量要少。这种局限性可以通过以下几步克服：
蛋白质在加样点处的沉淀及相互结合（蛋白分子）有时能被避免： ■样品必须含有尿素，非离子去污剂和IPG缓冲液或载体两性电解质。 ■用样品稀溶液加样（60—100μg蛋白质每100μl样品）
■在聚焦最初的1—2小时内，使电压限定在10—30V/cm范围内。 ■在样品中加入LiltrodexTM脂。
由于微量准备的加样，通过样品杯，可以加入更多量的样品。 ■在IEF过程中反复向样品杯中加样。
■在近阳极和近阴极附近同时加样（使用两个样品杯栅）。 3.5.3 等电聚焦的原则
在Multiphor设备中进行等电聚焦，（IEF）是在高压（达3500V）下进行的，并且由于IPG胶条内离子强度低，从而使电泳过程中电流非常低（往往低于1ma）.在等电聚焦过程中（IEF），当 蛋白质和其他带电成分向它们的平衡点移动时，电流就逐渐减少，然而电压却逐渐增加了。典型的等电聚焦规则往往在进行等电聚焦时要通过一系列的电压步骤。开始电压是相当低的，电压随后就逐渐上升。直到最终达到所希望的聚焦电压，并且在此电压下维持几个小时。在开始的低电压能减少样品的结合（蛋白质间的结合），并且使具有不同盐浓度的样品平行分离。对于那些加样量大的等电聚焦（IEF）来说，逐渐增加电压是明智的。（每条
IPG胶条100ug或更多）。许多因素能够影响完成聚焦所需的时间，各种有利于优化电泳最终结果的特定条件（样品和重水化液的成份，IPG胶条长度及pH梯度）需要经验性的判断来确定。在表13的范例规则中提供了等电聚焦，所需的近似时间。能增加电泳时间的另外一个原因是小离子的存在，在蛋白质聚焦前，他们先移至胶条的两端。蛋白质的量大也需更多的时间进行聚焦。
注意：
在100000总电压时下，聚焦过久不会产生问题，但继续进行跑胶，有可能产生水平的条纹，能在双向电泳的结果中看到。（参照6.0节 双向电泳结果故障排除）
3.5.4 规则举例—Multiphor
依表13给出的规则，适合于第一向的含有常规分析量的蛋白质样品的等电聚焦，其重水液中含有0.5—2%的IPG缓冲剂。由于蛋白质的性质，数量及加样方式的不同，最佳的聚焦时间有可能不同。为了分离加样量大的蛋白质（达1mg或更多），若需要，各规则的最终步聚焦的时间可以延长至100000电压时。 注意：
通过将样品加入重水液中加样，在PH6—11L IPG胶条上聚焦，明显需要延长完成聚焦的时间，在过程的最后阶段，增加推荐的电压时，7cm长的IPG胶条增至6—10倍，11cm长的IPG胶条增至5—8倍，13和18cm长的IPG胶条增至5—7倍。 3.5.5 进行跑胶
确保固相干胶托盘（Immobiline dry strip tray）上的电极连接正确，并且在MultiphorⅡ设备上盖上盖子，将盖子上的接口与电源供应仪相连。确保在EPS3501XL电源供应仪上的电流检测处于断开状态，开始进行等电聚焦。
随着等电聚焦的进行，溴酚蓝指示染料就向阳极移动。注意，在聚焦完成前，染料的前沿从IPG胶条上完全移出。因此，染料从胶上清除掉后不意味着等电聚焦完成了。若染料没有移动，则没有电流。若发生这种情况，检查电极和电极条之间是否接触良好，等电聚焦后，立即进行第二相电泳，或将IPG 胶条放在具有螺纹盖的试管内，并放在-40℃——-80℃条件下保存。7cm长的胶条，放在15cm的圆锥形试管中。11、13和18cm长的胶条放在25×200mm的带螺纹盖培养试管中。