概括起来，双向电泳的实验步骤为:
1样品的预处理
2 IPG胶条的重新水化 3 等电聚焦电泳（IEF） 4 IPG胶条平衡
5 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 6 显影
7 结果分析
1.2 设备的选取
根据电泳方法和等电聚焦（IEF）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）装置可以选择不同的设备。表1列出了可以从Amersham Pharmacia Biotech公司购得的设备。如果想要各种设备操作的详细资料，请参考各设备的使用手册。
等电聚焦设备的选择
Amersham Pharmacia Biotech提供了进行第一向电泳的两套不同的仪器：Multi-phorTMⅡ仪器及附件、IPGphorTM等电聚焦设备。
Multi-phorⅡ是一台多功能仪器，它能用来进行一些不同的电泳技术。对于双向电泳，它既能进行第一向电泳（IEF），也能进行第二向（SDS-PAGE）电泳。胶条的重新水化可以在固相干胶条再膨化盘(Immobiline Dry Strip Reswilling)内进行。重新水化后，IPG胶条被转移导电泳仪上进行第一向等电聚焦（IEF）。该电泳设备是由MultiphorⅡ平板装置和固向干胶条配套器件(Immobiline Dry Strip Kit )组成（图1）。这个设备能进行最多达十二条水化后的同样长度的IPG胶条进行任何规格的等电聚焦（IEF）。电源由EPS 350XL电源供应仪提供，MultiTempTMⅢ静热循环仪（Thermostatic Circulator）控制电泳时的温度。在IPGphor等电聚焦设备在IPG胶条上等电聚焦进行第一向的分离相当简单。IPGhor等电聚焦设备是由支撑槽和IPGphor部件组成，IPGphor的支撑槽既能用来进行IPG胶条重新水化又能用来进行等电聚焦（IEF），IPGphor部件能提供8000V的电压，并在内部安装了温度控制器。编程化的参量可以用来控制重新水化及其间的温度。等电聚焦的温度及最大电流，并且还可以控制在进行一次分离过程中各步骤及过程中电压的方式。多达12个同长度胶条支撑槽可以放在IPGphor平台进行任何一种规格的等电聚焦。由于胶条重新水化和等电聚焦（IEF）能不在使用者干预下连续进行，因此，它能在无人看管下过夜进行。其中一些对IPG胶条的操作能产生很少故障，如：胶条混淆、污染、空气接触及尿素的结晶，由于可以利用高电压，因此，分离速度非常快。表2列出了利用MultiphorⅡ设备和IPGphor等电聚焦设备在第一向电泳中的主要区别。
表2. 等电聚焦设备选择 最大电压
MultiphorⅡ
3500V
②
需要的附件设备
固相干胶膨化盘
固定干胶配套器件（Figure 1）
EPS350XL电源供应仪 MultiTempⅢ静热循环仪
IPG胶条支撑槽
等电聚焦的时间（IEF）
3—48小时
①
IPGphor
8000V 1.5--24小时
① 最佳的聚焦时间依赖于IPG胶条的长度及pH值的范围和样品的特性，进行相同的分离，IPGphor设备比MultiphorII设备快2倍。
② 出于安全原因，很高电压的是不可取的。
第二向电泳的设备选择
第二向电泳分离既可以在平板设备上进行也能在垂直设备上进行。表3提供了合适于第二向电泳的设备及胶的大小和于之相匹配的IPG胶条的长度，进一步的考虑因素在下面将讨论。
表3.第二向电泳设备选择
凝胶的近似
大小 （长×宽cm） 平板型
MultiphorII ExcelGel 垂直式
Hoefer miniVE或 SE260 Hoefer SE600 Hoefer DALT
1 在一片ExcelGel凝胶上，同时使用较短的胶条：两条11cm胶条或3条7cm胶条 2 若 使用1CM 宽度的空间
3 利用附加的分隔板，能容纳四块凝胶
凝胶数量
凝胶厚IPG胶条长度 度 （mm） （cm） 0.5
全部
总的电泳时
间 （h:min）
1:45 3:20 1:30 5:00 7:00—15:00
24.5×11 24.5×18
1
①
8×9 14×15
②
16×15 24×19
2 2或4 10
③
1,1.5 1,1.5 1,1.5
7 11,13 18
MultiphorII平板型设备
利用这种设备在大尺寸的凝胶上进行电泳能产生很好的分辨率，并且分离的速度相当快。
预制的ExcelGel凝胶产品为随时可用的凝胶和缓冲胶条提供了方便性。
MultiphorII（figure3）设备使用起来很方便，它是多功能的，同时可以进行第一向等电聚焦（IEF）和第二向十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）。
IPG 胶条中带有的蛋白质量能超出薄且水平的第二向电泳中的凝胶。因此在进行微量预备分离中，往往利用较厚垂直的第二向凝胶。若在进行第一向电泳
中，使用PH值范围为6—11的IPG胶条，一般不建议使用MultiphorII设备进行第二向电泳。
垂直型的设备
垂直型的设备使用起来相当方便，并且能同时进行多块胶的分离。垂直型的第二向凝胶既可以是1.5mm厚度又可以是1.0mm厚度。为了迅速起见，建议使用微型凝胶（Mini—Gel）电泳仪器——Hoefer miniVE（图4）或SE—260。这样，第二向电泳分离一般在1—2小时内能完成。如果要快速取得粗略的蛋白质情况或当样品中只有几种不同蛋白时，使用微型凝胶（MINI—GEL）进行第二向电泳是可取的。为了提高分离的分辨率和效果，建议使用标准规格的Hoefer SE600垂直型电泳设备。Hoefer SE260同时能容纳4块16cm长的凝胶。当与静热循环仪如MultiTEMPIII一起使用，内建的热量转换装置能起到降温作用，从而能提高分离的重复性。使用14cm宽度的凝胶，标准的垫片宽度为2cm。如果想利用在13cm IPG胶条两端的用来进行分子量标记的额外空间，使用1cm宽的垫片能进行16cm宽的凝胶的电泳。 为了得到最好的分辨率、重复性和提高样品容量，建议使用Hoefer DALT设备的大型凝胶类型。Hoefer DALT设备能容纳所有梯度的18cm的IPG胶条（加上分子量标记），并且最多能达10块凝胶同时跑电泳。一个内置的热量交换器和缓冲液循环泵能提供稳定的温度环境和对温度精确的控制。在Hoefer DALTMultip胶模中能同时浇注20或更多块的1—1.5mm厚的凝胶。
1.3实验室技术
? 在处理IPG胶条、SDS聚丙烯酰胺凝胶、ExcelGel缓冲胶条以及任何要
接触的仪器时，请戴上手套。使用手套能减少杂点和条带的污染。
? 将所有的器件用清洗玻璃器皿的去污剂清洗，并且用大量的蒸馏水冲洗。 ? 经常使用高纯度的试剂及蒸馏水。
第二部分 样品的预处理
2.0样品预处理一般方法
为了得到双向电泳最佳的结果，适当的样品预处理是相当重要的。由于样品和原始材料的种类繁多，在这里只对样品预处理的一般方法进行介绍。最佳的对各种类型的样品预处理方法必须通过经验来决定。若样品预处理能使样品中的蛋白质完全地溶解、分离、变性以及还原，那是最理想的。
当选用某种样品预处理方法时，对双向电泳要达到最终怎样结果有个清晰的把握是相当重要的。是否最终结果要尽可能地看到更多的蛋白质，还是仅仅想看到样品中感兴趣的蛋白质。额外的样品预处理能提高电泳最终结果的质量，但它能够使一些选择性的蛋白丢失。在这里应充分考虑提高样品质量和对样品进行完全的蛋白质预处理之间的相互关系。为了在复杂的蛋白混和物中辨别出特定蛋白，那些感兴趣的蛋白在电泳条件下必须是完全溶解的。溶解不同种类的蛋白样品应采用不同的条件和措施：一些蛋白质在天然条件下与膜、核酸及其它蛋白质形成复合物；一些蛋白质形成各种非特异性的集合体；一些蛋白质当离开它们一般条件时就沉淀了。溶解的效果取决于细胞破碎的方法、蛋白质溶解和浓缩的方法、去污剂的选择以及样品溶液的成分。在处理某种样品的时候，如果这些步骤中的任何一步没有充分完成，分离可能不能完全或失败，并且，一些信息也可能丢失。为了对细胞内蛋白作完全分析，细胞必须进行有效的破碎。细胞破碎方法的选择，依赖于样品是否来源与细胞、坚硬组织或其它生物材料以及是否要分析细胞内所有蛋白质或仅仅是细胞内小小的一部分。在2.1节中既介绍了缓和的破碎方法又介绍了剧烈的破碎方法。在细胞破碎过程中，蛋白酶也可能被释放出来。蛋白质的水解增加了双向电泳结果分析的难度，因此在细胞破碎和随后的预处理中，样品必须防止被水解。在2.2节中，讨论了蛋白酶的抑制方法。
如果只对组织或细胞中的一部分蛋白感兴趣，在样品预处理过程中可以采取预先分流的方法。如果想要分析的蛋白质来源于细胞器（细胞核、线粒体、原生质膜），感兴趣的细胞器应为进行双向电泳而进行蛋白质溶解之前采取差速离心或其它方法进行纯化。在进行双向电泳之前，样品可以在不同的抽提条件下利用溶解性进行预分流。参考资料[8，9]讲述了利用这种方法对样品进行处理。参照资料[10]可以获得蛋白质分流的相关主题。
样品中蛋白质沉淀和干扰物质去除是任选的步骤。是否采用这两步依赖于样品的自然属性和实验的最终结果。沉淀步骤在2.3节中介绍，它可被用来浓缩样品，也能被用来将蛋白质从潜在的干扰物中分离。除杂技术在2.4节中讲述，它可被用来减少来自样品的污染。如果，这些样品中的污染物不被除去，污染物有可能存在于双向电泳的最后结果中，这些污染物有盐离子、小离子分子、离子去污剂、核酸、多聚糖、脂类及酚类化合物。
通常对样品的处理越简单越好，举例来说，低蛋白质浓度高盐浓度的样品能按常规的方法分析和稀释，或去盐，然后利用冻干的方法将其浓缩，或利用TCA和预冷的丙酮将其沉淀，然后用重水化溶液将其再溶。一般用重水化溶液简单地对样品进行稀释可能足够了。若蛋白质浓缩存在问题或干扰物质干扰问题不能克
服，有必要使用蛋白质沉淀和除杂技术。
样品溶解液的成份对双向电泳极为重要，因为对第一向电泳而进行的蛋白质溶解处理必须既不影响蛋白质的pI值，也不能使蛋白样品存在于高传导性溶液中。通常，高浓度的尿素和一种或多种去污剂同时使用。样品溶解液在2.5节中进行探讨。
常规样品处理原则：
1．使样品处理的方法尽量简单、尽量避免蛋白质丢失。额外的样品处理能提高双向电泳最终结果的质量，但是有可能以丢失选择性蛋白为代价。
2．细胞破碎的方法必须以最小限度地减少蛋白质水解和其它形式的蛋白降解为原则，细胞破碎有可能的话可在低温进行，并且减少破碎过程中热量的产生。理想的情况是，细胞破碎应当直接在含有蛋白酶抑制剂的强变性溶液中进行。 3．样品溶解液是新配制的或在冰冻情况下储存，使用高纯度或去离子的尿素。 4．通过在等电聚焦（IEF）之前处理样品或将样品冰冻在-80℃冰箱内保存来保持样品的质量，避免使样品暴露而反复熔化。
5．通过超离心方法除去所有颗粒物，固体的小颗粒必须除去，因为它们能堵塞凝胶的孔隙。
6．为了防止蛋白质被修饰，不要在加入尿素时加热。当样品中存在尿素时，不要将样品处于37℃以上的环境中。提高温度能使尿素转化为氰化物，它能对蛋白质进行修饰。
7．为了得到关于为使用IPG胶条而准备样品方面更多的资料，请参照[11-13]。
2.1 细胞破碎的方法
在表4和5中列出了标准的细胞破碎的方法，包括破碎技术和所用的化学方法。细胞破碎必须在低温下进行。可能的话将样本放在冰块上并且利用预冷的溶液。如果这些方法被使用时，在细胞破碎过程中蛋白酶有可能被释放出来，因此，蛋白样品能防止被水解（参考2.2节）。直接将样品在高强度的变性裂解液中进行样品的破碎是可取的。这样能使蛋白水解酶迅速失活，并且也能使其它一些修饰蛋白的反应抑制。细胞的破碎往往在合适的能对感性趣的蛋白溶解的蛋白溶解液中进行。参考资料［4－5］，包含了常规组织破碎方面的信息。 2.1.1常规细胞破碎方法
当感兴趣的样品是由易于溶解的细胞组成的（组织培养细胞、血细胞以及
一些微生物），就用柔和溶解细胞的方法来破碎样品，这种方法在表4中列出。