注意：纸电极片必须润湿而不是湿透。 （２）安放纸电极片
在胶条支撑槽上移去盖子。用镊子抬起胶条的一端，在电极上放置纸片电极，然后将胶条这端放回至原来的位置上。在另一端重复这样做。然后盖上盖子。
3.6.3任选：在胶条重水化后加样。
若在胶条的重水化液中没有进行样品加样，样品可以在等电聚焦前立即
加样。
（１） 样品准备
将样品在入含有与重水化液相同成份的溶液中处理。
（２） 加样
除去支撑槽的盖，用微量移液器，将样品加入到胶条支撑槽的两侧的槽内将样品注入到IPG覆盖液以下。每个边上能加入到7.5ｕｌ的样品溶液（每槽内15ｕｌ或两侧的两个槽上总共加30ｕｌ）
注意：ＩＰＧ胶条背面没有渗透性，不要将样品加入到IPG胶条的背面。将盖子盖回原处。
3.6.4等电聚焦原则
在IPGPhor设备上进行等电聚焦需要很高的电压（达8000V）并且由于在IPG胶条内离子强度很低，电流相当弱（一般低于50uA每胶条）。在电泳过程中，由于蛋白质和其他带电的物质向平衡点靠近，电流就越来越弱，而电压就逐渐升高。进行一次典型的等点聚焦电泳，往往需经历一系列的电压过程，开始电泳时电压非常低。电压逐渐上升，直至达到预定电压，并在此电压下维持几个小时。开始电压很低能减少蛋白质分子间的相互结合并且能使具有不同盐浓度的样品平行分离。当加样量很大时（每条IPG胶条达100ug或更多），采取逐渐增大电压的措施是很明智的。
许多因素影响等电聚焦所需的时间，并且为了取得最佳的电泳结果，需要凭经验来确定每一种特定的条件（样品和重水化液成分，IPG胶条长度，和pH梯度）。表16举例提供了进行电泳所需的近似时间。能增加电泳聚焦所需的时间因素有离子和IPG 缓冲剂。离子在蛋白聚焦前能先移向IPG胶条两端。IPG缓冲剂能增加IPG胶条的导电性。当设备受到最高电流设置限制时，能使最终的电压很低。在IPG缓冲剂浓度高于0.5%时，有可能需要更长的聚焦时间。由于通过样品加样槽加载了大量的蛋白质和样品，通过延长聚焦时间和增加达到最大电压步骤，能提高电泳的效果。
注意：
通常利用电压时来对电泳进行拟订规格,而不用时间。在有限的电流下，实际所得到的最大电压和所得到分离速度是不同的，这依赖样品和重水化液成份的导电性，由于获得最佳聚焦的时间存在差异，在拟定电泳规则时一般愿意用电压时，因为它能弥补这种差异性。 注意：
将每条IPG胶条的电流超过50uA的限度是不可取的,因为这有可能产生过多的热量并且有可能损坏胶条和支撑槽,在极端条件下IPG胶条有可能发生燃烧. 注意：
在低于100000总电压时延长聚焦时间不存在问题，但是继续跑胶有可能产生水平的条纹,可以在双向电泳的最后结果中见到。
表16 在IPGphor等电聚焦设备上进行固相干胶等电聚焦的规则 50uA每条IPG 胶条
20℃在重水化和等电聚焦时
pH值梯度4-7L、3-10L和3-10NL
阶段 电压 持续时间（h:m） 电压时（vh） 梯度种类（Gradient type） 7cm 重新水化 12:001
1 500 0:30 250 step-n-hold 2 1000 0:30 500 step-n-hold 3 8000 1:00 8000 step-n-hold 11cm 重新水化 12:00
1 500 1:00 500 step-n-hold 2 1000 1:00 1000 step-n-hold 3 8000 2:00 16000 step-n-hold 13cm 重新水化 12:00
1 500 1:00 500 step-n-hold 2 1000 1:00 1000 step-ntrold 3 8000 2:00 16000 step-n-trold 18cm 重新水化 12:00
1 500 1:00 500 step-n-trold 2 1000 1:00 1000 step-n-trold 3 8000 4:00 32000 step-n-trold
pH梯度6-11L
阶段 电压 持续时间 电压时 梯度种类 7cm 重新水化 12:00
1 500 0:30 250 step-n-tord 2 1000 0:30 500 step-n-trold 3 8000 3:45 30000 step-n-trold 11cm 重新水化 12:00
1 500 1:00 500 step-n-trold
2 1000 1:00 1000 step-n-trold 3 8000 7:30 6000 step-n-trold
13cm 重新水化 12:00
1 500 1:00 500 step-n-trold 2 1000 1:00 1000 step-n-trod 3 8000 9:30 75000 step-n-trold 18cm 重新水化 12:00
1 500 1:00 500 step-n-trold 2 1000 1:00 1000 step-n-trold 3 8000 12:30 100000 step-n-trold 4 8000 2:30 20000 step-n-trold
(1) 为了方便起见,重新水化时间能进行调整，但必须长于10小时
(2) 在建议各阶段中，这电压可有能达不到
3.6.5规则举例--IPGhor
表16的规则适合于那些溶解在重水化液中具有常规分析数量的蛋白质
(1-50ug)进行第一向的等电聚焦。若在重水化液中含有0.5%IPG缓冲剂能提高分离效果。推荐的电流强度限度为每条胶50uA。推荐的电泳聚焦时间已经给出，但最佳的时间依赖于样品的自然属性蛋白质的数量及加样方法。请参阅IPGphor使用者手册（IPGphor use Manual）以获的怎样设计电泳程序的指令。 3.6.6进行电泳（Running a protocol）
确保胶条支撑槽正确的安置到IPGphor电泳仪的平台上。（利用标在电泳仪
平台侧面的标记调整好各胶条支撑槽，并且确保标成尖的胶条支撑槽的一端位于阳极上（标于电泳仪的背面），而钝的一端位于阴极上。请参阅IPGphor使用者手册）。检查位于各胶条支撑槽底部的外部电极触口是否于电泳仪平台上的接口接触良好。
盖上安全盖（SafetyLid）位于安全盖内侧的至少2/3的压力垫必须轻轻的压住各胶条支撑槽的盖面，以确保电极于电极之间接触良好。开始等电聚焦。
随着等电聚焦的进行，溴酚蓝示踪染料就向阳极移动。注意，在等电聚焦完成前染料必须完全从胶条相中移出，因此染料完全从胶条相中移尽不意味着样品已经聚焦。若染料不移动，这说明没有电流。如果染料不移动，请检查胶条支撑槽外部的电极表面与设备上的电极区域是否接触良好，以及内部电极的表面与胶条之间的接触。 注意：
用较短的IPG胶条进行等电聚焦或样品具有较高的电导性，预先设置的最大电压有可能达不到。
等电聚焦后迅速进行第二向分离，或将IPG胶条盛在带螺纹盖的试管内储存在-40—-80 条件下。7cm长度的胶条可以随意盛在15ml锥形的试管内，11、13和8cm长的胶条可以盛在25×200mm的带螺纹盖的组织培养试管内。
3.6.7 故障及排除
表17列出了在进行等电聚焦过程中可能碰到的故障及排除方法。
表17：第一向等电聚焦的故障及排除方法-IPGhor 症状（Symptom） 可能的原因
（Possible cause） 电流太低或为零
电源连接发生故障。
排除方法 （Remedy）
检查外部电极的接口：
位于胶条支撑槽底部的电极必须与电泳仪平面上的电极板接触区域形成金属于金属接触。
检查内部电极接口：凝胶必须与支撑槽内两端的电极接触。检查IPG胶条是否完全水化。胶条没有完全水化，能使胶条与电极间接触不良。 检查电流限度是否正确设置。检查实际在IPGphor平台上进电泳的实际胶条数与在规则内设置的胶条数是否一致。
处理样品，使样品盐浓度低于10mmol/L。建议的IPG缓冲剂浓度为0.5%。若样品的溶解存在问题，最高浓度可达2%。
电压太低或没有达到预定最大电压
进行实验的IPGphor设置不对。
导电性或离子强度过高。
产生火星或IPG胶条燃烧
电流设置过高，高于50mA。 不要使每胶条的电流高于 50mA。
PG胶条重水化不充分
在等电聚焦过程中IPG胶条变干燥 。
确保用足够的重水化液对IPG胶条进行重新水化。 除去在将胶条放入重水化液后在胶条下面产生的较大的气泡。检查整个胶条表面处于湿透状态。
经常加入IPG覆盖液，来防止水化后的IPG胶条失水。
第四部分 第二向 SDS-PAGE
4.0第二向 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳-概要
等电聚焦后，第二向的分离可以在不同的平板型或垂直型的设备上进行，这依赖于在1.2节‘设备选择‘中所讨论的因素。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳由四步组成：（1）第二向电泳凝胶的制备（2）在SDS缓冲液中平衡IPG胶条（3）将平衡后的IPG胶条安置在SDS 凝胶上（4）进行电泳。 在这本手册中，平衡步骤在这里首先介绍，因为这对垂直的和平板的电泳仪一般都适用。凝胶制备，IPG胶条的安装电泳的规则，另一方面是由胶条的胶性质决定的。在4.3节和4.4节中分别介绍了在垂直型的设备和在平板型设备中进行电泳的规则。然而，应当注意，第二向凝胶必须在平衡开始前预制。
4.1 SDS 聚丙烯酰铵凝胶电泳的背景。
SDS聚丙烯酰铵凝胶电泳是根据多肽的分子量的大小将多肽分离的。它是在含有十二烷基硫酸纳的聚丙烯酰铵凝胶中进行的。由于在样品中存在SDS和在凝胶中进行分离，蛋白样品内部所带的电荷量不是进行分离的因素。SDS是一种阴离子去污剂，通过以每克蛋白样品1.4克的比例缠绕在多肽连上使多肽变性。与SDS结合，使蛋白质自身的电荷产生屏弊形成带有永久性净负电荷的复合物。SDS也能打断氢键，阻碍疏水反应并且部分的展开蛋白分子，通过取消三级和二级结构，减小蛋白质在分子形态上的差异性。当使用一种还原试剂如DTT，蛋白质分子就完全舒展开来了。在半胱氨酸侧链间形成的双硫键能被打断，并且多肽能形成具有相同电荷密度棒状结构或每单位长度带的棒状结构。当蛋白质同时用SDS和还原剂进行处理，完全由分子量来分离蛋白成为可能。实际上，分子量的对数与SDS-多肽胶粒移动的相对距离之间存在着近似线性相关性。（注意：这种线性相关性只对某些分子量范围的蛋白有效，这种分子量范围是由聚丙烯酰胺的浓度百分比来衡量的。）
最常规使用的进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的体系是tris-甘氨酸缓冲液体系，在[63]中有Laemmli介绍。其它的缓冲液体系也能被利用，尤其是Schugger和VonJagow[64]的tris-N三甲基甘胺酸，这种缓冲剂用来溶解分子量范围低于10KD的多肽。
在MultiphorII平板电泳仪上利用预先浇铸好的ExleGet凝胶进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳需要使用不同的tris-一N-三甲基甘酸缓冲体系（tris-tricine buffer System）。
4.2 IPG胶条平衡
平衡步骤是将IPG胶条浸没在进行第二向分离所必需的SDS缓冲体系中。平衡液包含：缓冲剂，尿素，还原剂、SDS甘油、和染料。另外可选用碘代乙酰胺来代替还原剂。