接着单个的酸性或碱性缓冲基团。它们的一般结构如下：
CH2=CH-C-NH-R R R=弱酸性或碱性缓冲基团
固相pH梯度是由使用两种溶液形成的，一种包含一种相关的酸性的丙稀酰胺缓冲剂混合物另一种包含相应碱性的混合物。在两种溶液中不同缓冲剂的浓度决定着pH梯度的范围和状态的形成。两种溶液都含有丙稀酰胺单体和催化剂。在聚合过程中，丙稀酰胺缓冲剂的丙稀酰胺部分与丙稀酰胺和双丙稀酰胺单体聚合形成聚丙烯酰胺凝胶。图8是聚丙烯酰胺基质与缓冲基团结合的图示。
为了提高工作效率和简化处理，IPG凝胶浇注在塑料支持物上。随后洗去凝胶上的催化剂和没有聚合的单体，这些物质不仅能修饰蛋白而且能影响分离。最后将胶干燥并切成3mm宽的胶条。最终的IPG胶条能够用含有等电聚焦所必需成份的重新水化液重新水化。
等电聚焦（IEF）使用IPG胶条在平板电泳仪上水平进行。使用平板形式进行电泳有如下优点：
■等电聚胶需要有效的降温来控制严格的温度，在连接有静热循环仪或Peltier冷却盘水平的瓷性冷却盘能很容易达到要求。
■等电聚焦需要高强度的电场来得到精确的聚焦条带，因此必须使用高电压。平板式设计是最经济的方法，在如此高压下能达到足够的安全标准。
A.Gorgetal.[3.4]是使用IPG胶条进行双向电泳的第一向电泳的创始者，这本手册中的一些规则大部分建立在A.Gorg和她的同事的工作之上的。IPG胶条在含有必需成份的重水化液中重新水化，并且也可能含有样品蛋白。（重新水化液在3.4节中详细介绍）等电聚焦是在贯窜IPG胶条电压逐渐增加的情况下进行的，最终至少也得达到3500V，并且维持这个电压至少几千电压时。等电聚焦以后，IPG胶条在平衡液中平衡，随后安装到平板的或垂直的SDS—聚丙烯酰胺凝胶上。当IPG胶条被用来进行第一向分离时，在分离效果与重复性上，双向电泳都很优秀。IPG胶条比用载体两性电解质产生的pH梯度具有明显的改善：
■第一向电泳的重复性好，因为共价形成的梯度不能漂移。
■具有塑料支撑的IPG胶条易于处理，可以用镊子或着戴手套用手指直接从
任何一端将它们拿起。
■由塑料支撑的胶片可以防止凝胶的拉伸或折断。
■在任何单条IPG胶条上，IPG技术能增加有用的pH范围。这样可以分离更多种类的碱性和酸性蛋白。
■IPG胶系能容纳更多的蛋白样品。[59]
■样品能在IPG胶条重新水化的过程中加入。[60，61]
■预先浇铸好的IPG胶条可以从Amersham Pharmalia Biotech公司购得。这些预先制好的干IPG胶条省去了对有毒的丙烯酰胺单体的操作，制备的时间和精力明显下降了。并且pH梯度的重现性得到了保障。
3.2固相pH梯度选择
可以从Amershampharmaia Biotech公司购得pH值梯度在4—7L（线性），6—11L（线性），3—10L（线性）和3—10NL（非线性）的预制IPG胶条（固相pH干胶条，Immobiline Drystrip gels）。可得到的胶条长度为7，11，13和18cm，pH3—10L胶条在pH3—10之间具有线性的pH值梯度。pH3—10NL胶条具有一个粗略的象S型的梯度，这样在pH5—7之间，电泳效果得到明显改进。若需要特定的pH值梯度，在[62]中给出了准备一般宽窄的固定pH梯度（immobiliztd pH gradients）的方法。
pH3—10的IPG胶条能够在单块双向凝胶上显示最广的蛋白质分布。较窄的pH分布范围能很好分离特定pH范围内的蛋白。
3.3加样方法的选择
样品既能通过将它放入重新水化液中，也能利用样品杯或上样槽直接在水化后的IPG胶条上加样。一般往往喜欢将样品放入重新水化液中将样品加入到IPG胶条上。（参照3.4节）利用这种加样方式的优点如下：
■这种方法能使大量的蛋白进行加样和分离。 ■这种方法能用很稀的样品进行加样。
■由于没有分离的加样点，这种方法消除了当样品利用样品杯加入时在该点产生沉淀的现象。
■这种方法在技术上是简单的，可以避免使用样品杯时可能产生的渗漏问题。 当然了，有些也有在等电聚焦（IEF）前在重新水化后立即加样的，这是有原因的：
■若存在着蛋白水解或其它蛋白的修饰问题，与样品一同过夜进行重新水化是不可取的。
■当样品利用样品杯或样品槽加样时，在pH6—11L IPG胶条上将样品加在阳极，往往能得到较好的结果。
使用MultphorⅡ和固向干胶条设备的在重新水化后加样的方法在3.5.2D节中给出。样品加入到精确固定在IPG胶条表面的样品杯中。通过加样杯，每条胶条能加多达100 μ l的样品。
重新水化后利用IPG Phor设备加样的方法在3.6.3节中给出。样品加入在位于两端的加样槽中，能在两端分别加入多达7.5μl的样品溶液。（若两端的所在槽都使用，每个样品槽加15μl，那么总共能加30μl的样品。）
3.4 IPG胶条重新水化溶液
IPG胶条在进行IEF前必须重新水化。若利用MultphorⅡ设备进行IEF，IPG胶条在固相干胶条膨胀托盘（Immobiline Drystrip Reswelling Try）上进行水化，若使用IPGphor，则在IPGphor胶条支撑槽内（IPGphor Strip holders）进行水化。
含有或不含样品的重新水化液加入到膨胀托盘或IPGphor胶条支持架的储液槽中,随后各胶条就分别吸收重新水化液。水化后的胶条宽3mm大约0.5mm厚。
3.4.1重水化液的组成
最佳的重水化液的选择依赖于样品中特定蛋白溶解性的要求。一般的重水化液含有尿素，非离子或两性去污剂，DTT，IPG缓冲液（Amerham Phcrmcuia Biotecll），其pH值适合于IPG胶条pH值范围和染料pH值。也有可能包含样品。各种成分的作用和浓度在如下描述： →尿素（urea）
使蛋白质溶解和变性，通过展开蛋白质分子，使它们的内部带电氨基酸分子暴露。通常使用浓度为8mol/L，但为了使蛋白质完全溶解的需要，尿素的浓度往往增加到9或9.8mol/L。最近有报导，除了使用尿素，使用硫脲能进一步改善蛋白质的溶解性，尤其是对于膜蛋白。 [9，13，51-53]
→去污剂（Detergent）
促使疏水蛋白质溶解并减少蛋白质间的结合。去污剂分子必须带电量为零——只使用非离子或两性去污剂。一般常用CHAPS，TritonX-100，或NP-40使用浓度为0.5-4%。
→还原剂（Reductant）
打断二硫键使蛋白质完全展开，往往使用DTT或DTE（20-100mmol/L）。也可以使用2-巯基乙醇替代，但需要更高的浓度并且杂质能产生干扰[5 6]。最近的报导指出非硫还原剂磷酸三丁醇酯（Tributylphosphine）能被用来进行第一向等电聚焦。在使用前加入还原剂。
→IPG缓冲液（载体两性电解质混合物）
能提高分离效果和样品溶解度，尤其是加样量多时。形成各PH值范围的IPG胶条的IPG缓冲液是各种载体两性电解质的混合物，它在等电聚焦过程中不影响梯度结构，还能促进样品的溶解度，并且等电聚焦过程中在整个梯度范围内能产生更一致性的导电性。并且IPG缓冲液是有特殊组成的，它不影响银染效果。表9列出了进行重水化时各IPG缓冲液的最终建议浓度。
建议IPGphor体系的IPG缓冲液浓度为0.5%，若样品的溶解存在问题，可
以使浓度达到2%。
注意：缓冲液浓度在建议浓度的上限时，在IEF过程中有可能增加使电压达到设置最大值时所需的时间，从而增加完全聚焦所需的时间。
IPG缓冲液能加入在重水化液中储存，也可在使用前现加。（当多条具有相同PH范围的IPG胶条使用时，IPG缓冲剂能包含在重水化液中储存。当同种储存的重水化液来处理不同PH值范围的IPG胶条时，在使用前将IPG缓冲液分别加入到单份储存液中。）
→指示染料（Tracking dye）(溴酚蓝)
指示从开始进行电泳时，等电聚焦（IEF）的进程。若指示染料中没有向阳极移动时，就说明没有电流移动。然而注意：在样品聚焦前，使指示剂很好地离开胶条。
→样品（Sample）
样品能通过加在重水化液中进行加样。在等电聚焦前每条胶条多达1㎎的样品能稀释到或再溶到重水化液中。在检测和显影方法的使用中部分介绍了样品所需的数量。辐射标记所需的样品量少，银染一般需要100ug的样品，考马司兰染色和预备加样需要更多的样品。
表9：在重水化液中的IPG缓冲剂加量
IEF设备
胶条HP跨度
加入重水化液中的载体两性电
解质 IPG缓冲液的PH范围与IPG胶条PH范围相同 PH6-11LIPG缓冲液
IPG缓冲液的PH值范围与IPG胶条PH值范围相同
推荐浓度 2%IPG缓冲液 （50ul每2.5ml） 0.5%IPG缓冲液(12.5ul每2.5ml)
0.5%IPG缓冲液(12.5ul每2.5ml)
MultiphorⅡ 4-7L，3-10L，
或3-10NL MultiphorⅡ IPGphor
6-11L
4-7L，3-10L，3-10NL 或6-11L
3.4.2重水化液的准备
① 准备重水化储存液。在附录溶液B和C中列出了配制方法（选择合适实验的方法）。
注意：储存液在-20℃以2.5ml为单位储存。
② 在使用前，缓慢熔化2 .5ml单位的储存液。如果IPG缓冲液没有加入到重水化储存液中加入正确量的IPG缓冲液。（参见表9） ③ 加入7mgDTT和样品（若需要的话）
注意：在使用前，DTT和样品必须是新加入的。
3.5 MutiphorⅡ和固相干胶条设备（Immobiline Dry Strip Kit）
3.5.1IPG胶条重新水化——固相干胶条膨化托盘（Immobiline Dray-strip Reswelling Tray）
固相干胶条膨化托盘具有12个独立的储液槽。每一条储液槽都能安装长达18㎝长的单条IPG胶条。分离式的储液槽能减少每条IPG胶条的重水化液体积。 (1)膨化托盘（图9）的准备
从托盘上完全移去保护盖，通过旋转调平脚使托盘水平，直至气泡位于灵敏水平器的中间，确保托盘的干净和干燥。
(2)加入重新水化液 根据表10所述，将适量的重水化液用吸管加入到各槽中。将溶液放入到槽中间，除去任何大的气泡。
注意：确保所有样品被吸收，不要加入过量的重水化液。
表10：每条IPG胶条的重水化液体积
IPG胶条长度（cm） 7 11 13 18 24
① 若加样时包含样品
每条胶的总体积(ul)① 125 200 250 340 450
（3）安放IPG胶条（图10）
从IPG胶条除去包装，放低胶条一端，并且使胶条成尖的一端靠着槽的倾斜的一端；降低另一端，使胶条靠近溶液。为了使胶条被溶液浸润，慢慢的抬高或放低胶条并且来回的沿着液体表面滑动。注意不要使IPG胶条底部产生气泡。