难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70 ~ 80%。
7．流动相可选择范围广 它可用多种溶剂作流动相，通过改变流动相组成来改善分离效果，因此对于性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。 8．馏分容易收集 更有利于制备。
§3.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
一、与GC 比较65/1；基本概念及理论基础与GC一致；
主要区别：流动相为液体。气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。
二、对色谱峰扩展及色谱分离影响的因素： 1.涡流扩散项 ： He = 2λdp 含义同GC法 2.纵向扩散项65/-1： Hd = CdDm/u； 在LC中可略,GC中重要；
3.传质阻力项：a.固定相传质阻力项； b.流动相传质阻力项.
结论66/-1；改进固定相就成为提高液相色谱柱效一个重要问题. 综合分析，由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化可归纳为： H=A+B/u+Cu 3-6
形式与GC一致，其主要区别在于扩展项可以忽略，影响柱效的主要因素是传质项。67/1；-2.
从3-6式看出，H近似正比于d2p ，
所以67/2;9:减小粒度是提高柱效的最有效途径。
4.其它影响因素68/2；
柱外展宽：指色谱柱外各种因素引起的峰扩展. a.柱前展宽：主要由进样所引起；
b.柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积所引起.为此，连接管的体积、检测器的死体积应尽可能小。
§3.3高效液相色谱的主要类型及其分离原理
类型：液-液色谱；液-固色谱；离子交换色谱；离子对色谱；离子色谱；空间排阻色谱 一.液-液分配色谱法及化合键合相色谱 1.特点：a.流动相和固定相都是液体 b.两相应互不相溶，有明显的分界面 2.分离机制：溶质在两相间进行分配
K = cs/cm = kVm/Vs
分离的顺序决定于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大.而且流动相的种类对分配系数有较大的影响.
3.分类：
a.正相液-液色谱法：流动相的极性小于固定液的极性；
b.反相液-液色谱法：流动相的极性大于固定液的极性；
c.化学键合固定相：将各种不同有机基团通过化学反应共价键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相。代替机械涂渍的液体固定相。这不仅避免了液体固定相流失的困扰，还大大改善了固定相的功能，提高了分离的选择性，化学键合色谱适用于分离几乎所有类型的化合物。
反相化学键合相色谱法已成为高效液相色谱法中应用最广泛的一个分支. 二.液-固色谱法（或液-固吸附色谱法）
液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，位于其表面的原子、离子或分子的性质是多少不同于在内部的原子、离子或分子的性质的。表层的键因缺乏覆盖层结构而受到扰动。因此，表层一般处于较高的能级，存在一些分散的具有表面活性的 吸附中心 。因此，液固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分离，故也称为液固吸附色谱。
吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附，呈现高的保留值；当组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，易于吸附。从而使吸附色谱成为分离几何异构体的有效手段；不同的官能团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按族分离化合物。 1.特点：流动相为液体，固定相为吸附相。 2.分离机制
Xm + nSa = Xa + nSm
K = [Xa][Sm]n / [Xm][Sa]n
3.结论69/-5： 显然，分配系数大的组分，吸附剂对它的吸附力强，保留值就大. 4.作用：a.适用分离相对分子质量中等油性试样。
b.对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。 缺点：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象 三.离子交换色谱法 1.分离机制70/2；
2.适用范围70/3；凡能在溶剂中电离的物质一般 均可用该法进行分离。 3.交换：KX = [- NR4+X-][Cl-] / [- NR4+Cl-][X-]
DX =[- NR4+X-]/[X-]= KX[- NR4+Cl-]/[Cl-] 3-9
4.结论：a.分配系数D愈大，表示溶质的离子与离子交换剂的相互作用愈强。 b.亲合力高的，在柱中保留值就愈大.
5.应用：a.分离离子或可离解的化合物。 b.已成功地分离氨基酸、核酸、蛋白质等
四、离子对色谱法
1.特点：分离效能高，分析速度快，操作简便. 2.分离机制（P71）
3.分离过程：流动相中待分离有机离子与固定相或流动相中带相反电荷的对离子结合，形成离子对化合物，然后在两相间进行分配. X+水相 + Y－水相 &8596; X+Y－水相
KXY= [ X+Y－ ]有机相 / [ X+ ]水相&8226; [ Y－ ]水相 DX = [ X+Y－ ]有机相 / X+水相 = KXY&8226; [ Y－ ]水相 4.分类：a.正相离子对色谱法；
b.反相离子对色谱法.
5.应用：解决了以往难分离混合物的分离问题，例如各种强极性的有机酸碱。 五、离子色谱法
1.固定相:离子交换树脂 流动相:电解质溶液 检测器:电导检测器
主配件：抑制柱 2. 流程图：fig3-2
3.分离机制 （阴离子为例）
a.双柱型：化学抑制型离子色谱法；
b.单柱型：非抑制型，用低电导的洗脱液；
4.应用：从无机和有机阴离子到金属阳离子，从有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用该法分析
六、空间排阻色谱法 1.固定相：凝胶
2.机制73/-9：类似于分子筛作用，分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流体力学体积和分子大小有关.
3.分离示意图，fig3-3 a.排斥极限A点74/2;3:
b.全渗透极限B点74/2;6:
相对分子质量介于上述两个极限之间的化合物，将按相对分子质量降低的次序被洗脱. 4.特点75/2;3://
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高效液相色谱仪
高效液相色谱仪主要有分析型、制备型和专用型三类。 一般由五个部分组成：
高压输液系统 —— 进样系统 —— 分离系统—— 检测系统 —— 数据处理系统 一. 高压输液系统
贮液装置、高压输液泵、过滤器、脱气装置等
1. 贮液器：贮液器用于存放溶剂。溶剂必须很纯，贮液器材料要耐腐蚀，对溶剂呈惰性。贮液器应配有溶剂过滤器，以防止流动相中的颗粒进入泵内。溶剂过滤器一般用耐腐蚀的镍合金制成，空隙大小一般为2&61549;m。
2. 脱气装置：脱气的目的是为了防止流动相从高压柱内流出时，释放出气泡进入检测器而使噪声剧增，甚至不能正常检测。
3. 高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪的重要部件，是驱动溶剂和样品通过色谱柱和检测系统的高压源，其性能好坏直接影响分析结果的可靠性。 对高压泵的基本要求是：
①流量稳定；②输出压力高，最高输出压力为50Mpa；③流量范围宽，可在0.01～10ml／min范围任选。④耐酸、碱、缓冲液腐蚀。⑤压力波动小。
梯度洗脱装置 梯度洗脱是利用两种或两种以上的溶剂，按照一定时间程序连续或阶段地改变配比浓度，以达到改变流动相极性、离子强度或pH值，从而提高洗脱能力，改善分离的一种有效方法。当一个样品混合物的容量因子是范围很宽，用等度洗脱时间太长，且后出的峰形扁平不便检测时，用梯度洗脱可以改善峰形、并缩短分离时间。HPLC的梯度洗脱与GC的程序升温相似，可以缩短分析时间，提高分离效果。使所有的峰都处于最佳分离状态，而且峰形尖而窄。 二. 进样器
进样器一般要求密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力
和流量波动小，并便于实现自动化。
高压进样阀是目前广泛采用的一种方式。阀的种类很多，有六通阀、四通阀，双路阀等。以六通进样阀最为常用。 三.分离系统
色谱分离系统包括色谱柱、固定相和流动相。色谱柱是其核心部分，柱应具备耐高压、耐腐蚀、抗氧化、密封不漏液和柱内死体积小、柱效高、柱容量大、分析速度快、柱寿命长的要求。通常采用优质不锈钢管制成。
色谱柱按内径不同可分为常规柱、快速柱和微量柱三类。
常规分析柱柱长一般为10~25cm，内径4 ~ 5mm，固定相颗粒直径为 5 ~ 10 &61549;m。为了保护分析柱不受污染，一般在分析柱前加一短柱，约数厘米长，称为保护柱。 （微量分析柱内径小于l mm，凝胶色谱往内径3～12 mm，制备往内径较大，可达25 mm以上。）
四. 检测系统
检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号，常用检测器有紫外吸收、荧光、示差折光、化学发光等。
1. 紫外可见吸收检测器（ultraviolet－visible detector，UVD）
紫外可见吸收检测器（UVD）是HPLC中应用最广泛的检测器之一，几乎所有的液相色谱仪都配有这种检测器。其特点是灵敏度较高，线性范围宽，噪声低，适用于梯度洗脱，对强吸收物质检测限可达1ng，检测后不破坏样品，可用于制备，并能与任何检测器串联使用。紫外可见检测器的工作原理与结构同一般分光光度计相似，实际上就是装有流动地的紫外可见光度计。
（1）紫外吸收检测器：
紫外吸收检测器常用氘灯作光源，氘灯则发射出紫外-可见区范围的连续波长，并安装一个光栅型单色器，其波长选择范围宽（190nm～800nm）。它有两个流通池，一个作参比，一个作测量用，光源发出的紫外光照射到流通池上，若两流通池都通过纯的均匀溶剂，则它们在紫外波长下几乎无吸收，光电管上接受到的辐射强度相等，无信号输出。当组分进入测量池时，吸收一定的紫外光，使两光电管接受到的辐射强度不等，这时有信号输出，输出信号大小与组分浓度有关。
局限：流动相的选择受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶剂不能做流动相，每种溶剂都有截止波长，当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收检测器的工作波长不能小于溶剂的截止波长
（2）光电二极管阵列检测器（photodiode array detector， PDAD）：
也称快速扫描紫外可见分光检测器，是一种新型的光吸收式检测器。它采用光电二极管阵列作为检测元件，构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接收器上的全部波长的光信号，然后对二极管阵列快速扫描采集数据，得到吸收值(A)是保留时间(tR)和波长(&61548;)函数的三维色谱光谱图。由此可及时观察与每一组分的色谱图相应的光谱数据，从而迅速决定具有最佳选择性和灵敏度的波长。
下图是单光束二极管阵列检测器的光路图。光源发出的光先通过检测池，透射光由全息光栅色散成多色光，射到阵列元件上，使所有波长的光在接收器上同时被检测。阵列式接收器上的光信号用电子学的方法快速扫描提取出来，每幅图象仅需要10ms，远远超过色谱流出峰的速度，因此可随峰扫描。
图1 二极管阵列检测器光路图
2．荧光检测器（fluorescence detector， FD）
荧光检测器是一种高灵敏度、有选择性的检测器，可检测能产生荧光的化合物。某些不发荧光的物质可通过化学衍生化生成荧光衍生物，再进行荧光检测。其最小检测浓度可达0.1ng／ml，适用于痕量分析；一般情况下荧光检测器的灵敏度比紫外检测器约高2个数量级，但其线性范围不如紫外检测器宽。
近年来，采用激光作为荧光检测器的光源而产生的激光诱导荧光检测器极大地增强了荧光检测的信噪比，因而具有很高的灵敏度，在痕量和超痕量分析中得到广泛应用。
3. 示差折光检测器（differential refractive Index detector， RID） 示差折光检测器是一种浓度型通用检测器，对所有溶质都有响应，某些不能用选择性检测器检测的组分，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等，可用示差检测器检测。示差检测器是基于连续测定样品流路和参比流路之间折射率的变化来测定样品含量的。光从一种介质进入另一种介质时，由于两种物质的折射率不同就会产生折射。只要样品组分与流动相的折光指数不同，就可被检测，二者相差愈大，灵敏度愈高，在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓度成正比。
4. 电化学检测器 （elec）chemical detector， ED）
电化学检测器主要有安培、极谱、库仑、电位、电导等检测器，属选择性检测器，可检测具有电活性的化合物。目前它已在各种无机和有机阴阳离子、生物组织和体液的代谢物、食品添加剂、环境污染物、生化制品、农药及医药等的测定中获 得了广泛的应用。其中，电导检测器在离子色谱中应用最多。 电化学检测器的优点是：
①灵敏度高，最小检测量～般为ng级，有目可达pg级； ②选择性好，可测定大量非电活性物质中极痕量的电活性物质； ③线性范围宽，一般为4～5个数量级； ④设备简单，成本较低；⑤易于自动操作。
5. 化学发光检测器 （c。iluminescence detector， CD）
化学发光检测器是近年来发展起来的一种快速、灵敏的新型检测器，因其设备简单、价廉、线性范围宽等优点。其原理是基于某些物质在常温下进行化学反应，生成处于激发态势反应中间体或反应产物，当它们从激发态返回基态时，就发射出光子。由于物质激发态的能量是来自化学反应，故叫作化学发光。当分离组分从色谱柱中洗脱出来后，立即与适当的化学发光试剂混合，引起化学反应，导致发光物质产生辐射，其光强度与该物质的浓度成正比。 这种检测器不需要光源，也不需要复杂的光学系统，只要有恒流泵，将化学发光试剂以一定的流速泵入混合器中，使之与柱流出物迅速而又均匀地混合产生化学发光，通过光电倍增管将光信号变成电信号，就可进行检测。这种检测器的最小检出量可达10-12g。 五. 数据处理系统
早期的 HPLC 只配有记录仪记录色谱峰，用人工计算 A或 H。随着计算机技术的发展，简单的积分仪，可自动打印出 H、A和 tR，作一些简单的计算，但不能存储数据。
现在的色谱工作站功能增多，一般包括：色谱参数的选择和设定：自动化操作仪器；色谱数据的采集和存储，并作―实时