项目名称： 表观遗传学的结构机理研究 起止年限：依托部门：许瑞明 中国科学院生物物理研究所 2009.1至2013.8 中国科学院
首席科学家：
一、研究内容
本项目的主要研究内容是以X光晶体学方法为主要研究手段，结合其它生物物理和生物化学方法，深入研究以下几项表观遗传学的重要问题：
组蛋白修饰酶的反应机理和底物特异性
主要几类组蛋白共价修饰有乙酰/去乙酰化、甲基/去甲基化、磷酸/去磷酸化、泛素/去泛素化。其中组蛋白的乙酰/去乙酰化和甲基/去甲基化是近年来表观遗传学的研究热点，这也是本项目的研究焦点。尽管这方面的结构研究已有一定的进展，但还有一些重要的问题并不清楚。例如组蛋白H3的第四个赖氨酸(H3K4)和H4K20的三甲基化酶的结构和反应机理还有待解析；到目前为止H3K36和H3K27的甲基化酶识别其对应的赖氨酸的机理也不清楚。我们将着重研究H3K4、H3K36、H3K27和H4K20的甲基化和去甲基化酶的结构机理研究。同时，我们也将进行对组蛋白乙酰/去乙酰化、泛素/去泛素化和磷酸化酶的复合物的结构和功能的深入研究。
修饰后的组蛋白识别
目前已知的识别组蛋白乙酰化的有Bromo结构域，识别甲基化后赖氨酸的有Chromo,Tudor,PHD,WD40等结构域。其中有的PHD和WD40结构域也和未修饰的组蛋白结合。可以预测的是同一个修饰过的组蛋白末端残基将有不同蛋白质中的以上或全新的结构域识别。例如甲基化后的H3K4可被PHD和Tudor结构域识别。更重要的一个科学问题是一个组蛋白上的多个或多种修饰是怎样被同时识别的。本项目将发展化学生物学新方法来制备有关的组蛋白样品，利用Ｘ光晶体学、电镜和生物化学、分子生物学方法来研究组蛋白多种修饰的共识别以及新发现的单识别模式，例如PCL的PHD结构域与甲基化后的H3K27的结合。
组蛋白修饰酶的活性调控和蛋白质－蛋白质相互作用
有些组蛋白酶，例如大部分乙酰化酶和甲基化酶，单独就具有酶活性；而另一些组蛋白酶，例如大部分去乙酰化酶和部分甲基化酶和乙酰化酶，只有与其它蛋白质形成复合体时才有酶活性。还有一种情况就是复合体的形成大大地提高了酶活性。组蛋白修饰酶复合体里亚基之间的相互作用是怎样激活或者提高组蛋白修饰酶的活性的结构机理研究在国际上到目前为止还是空白，这也是本项研究的重点。同时，我们也将紧密追踪表观遗传学发展新动向，对于新发现的重要的组蛋白修饰酶与其它蛋白的相互作用，包括HDAC与含PDZ结构域蛋白质的相互作用，及时地阐明它们的结构机理。
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基于组蛋白修饰酶的药物设计
很多组蛋白修饰酶在疾病发生中有很大的作用。例如H3K4，H3K36和H3K79甲基化酶MLL，NSD1和hDot1L在白血病里，而H3K9和H3K27甲基化酶SUV39和EZH2在多种癌症里都有很大的作用。我们过去的结构生物学研究都涉及了相关的甲基化酶。我们将在本项目里继续深入研究与重大疾病相关的组蛋白修饰酶的结构和功能，利用所得到的结构信息用计算生物学和化学生物学的方法进行药物设计的初期研究。
以上几个方向将是本项目今后五年的研究重点。为了给进一步深入研究打下基础，我们也将同时开展蛋白质与核小体复合体的探索性研究。这项研究的意义是尽管核小体的晶体结构解析已完成10年多了，到目前为止唯一只有一个与短肽结合的复合体结构被解析。染色质的高级结构及其调控涉及到多种不同的蛋白质与核小体的相互作用，所以这方面的研究将是今后表观遗传学结构机理研究的重点。我们的先期研究工作将从技术层面上探索单个和多个核小体，尤其是包括修饰后的组蛋白的核小体的高效重组途径。
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二、预期目标
1、总体目标
本项目的总体目标是使我国在表观遗传学的结构机理研究水平跻身于国际先列。具体的目标为：(1)通过不懈的努力在表观遗传学机理研究领域做出几项有标志性的工作。我们选择的突破口为组蛋白修饰酶的复合体结构，蛋白质和核小体的复合体结构，以及异染色质(heterochromatin)的三维结构研究。(2)在组蛋白修饰酶的催化机制和底物识别机理，以及修饰后的组蛋白的识别研究做作出广泛的贡献。(3)利用所获取的与人类健康和疾病有重大关系的蛋白质三维结构信息开展药物设计研究。(4)通过本项研究建立起一只多学科相互合作的高水平表观遗传学研究队伍，培养一批勇于探索、求是创新的年青研究人才。
2、五年预期目标
我们期望完成10个以上在表观遗传学里有重要作用的蛋白质和蛋白质复合体的结构和功能研究。力争部分工作在高影响力的国际杂志(例如Nature, Science，Cell)上发表。建立起系统地表达组蛋白修饰酶以及在表观遗传学里有重要作用的蛋白质的表达、纯化、结晶和功能分析平台。探索重组核小体以及包括修饰后组蛋白的核小体的有效途径，为进一步研究蛋白质-核小体相互作用开创局面。从已知化合物文库中筛选出2?4个对HDAC活性有抑制作用的小分子化合物；用计算机辅助设计，合成，得到一组结构全新的、针对HDAC小分子抑制剂；并进行结构修饰和优化。为深入开展多学科合作、高复杂性的表观遗传学结构机理研究打下深厚的基础。
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三、研究方案
1、总体研究思路
本课题选择在表观遗传调控过程中具有重要生物学意义、与重大疾病的发生和发展
相关的蛋白体系为研究对象，特别是对一系列组蛋白修饰酶和与其相互作用的调控蛋白的结构和功能研究。我们将运用现有的各种基因克隆、蛋白质表达和纯化技术获取大量蛋白质和蛋白质复合物的样品；运用X-射线晶体衍射法和溶液NMR方法测定它们的晶体结构或溶液动态结构，通过结构分析揭示组蛋白修饰酶的活性中心组份和结构、底物和产物特异性的决定因素、蛋白质-蛋白质相互作用的位点、作用的方式、以及调控网络关系；我们将用化学生物学的方法合成有活性的修饰后的组蛋白将其作为组蛋白去甲基化和去乙酰化酶的底物，用来制备修饰过的核小体和提供表观遗传细胞生物学研究的新手段；冷冻电镜的手段来研究表观遗传中的大复合体和染色质的高级结构；结合结构生物学、化学生物学和药物化学的方法进行药物设计和筛选。同时，我们也将运用生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学和生物信息学等方法对于组蛋白修饰酶和相关的复合物进行基于结构信息的功能研究，这包括利用模式生物C.elegans的研究平台探索组蛋白的表观遗传修饰在个体发育，尤其是C.elegans寿命，性腺发育和生殖发育中的调控作用。
2、技术路线
本课题主要运用同生物信息学、分子生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学、结构生物学和其它生物物理等方法, 针对一些参与组蛋白修饰过程并具有重要生物学意义与重大疾病相关的蛋白和蛋白复合物，开展功能、结构、相互作用关系、分子作用机制、以及临床应用可能性的研究。主要研究方法和技术路线概述如下：
（1）可溶性蛋白质和蛋白质复合物样品的制备
为获得可用于结构和功能研究的大量可溶性蛋白质，我们将首先在大肠杆菌体系中构建和表达目标蛋白。同时，对一些溶解性差、表达量低的蛋白质，我们将尝试其它的原核和真核表达载体和系统（包括酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞），表达不同标签的融合蛋白以及无细胞体外蛋白表达系统等进行表达条件的摸索。一旦表达成功，我们将尝试不同的蛋白质分离和纯化方法（包括亲和柱层析、离子交换柱层析、疏水柱层析和分子筛柱层析），以期获得具有活性、且适合于结构和功能研究的蛋白质。对功能特别重要的蛋白质或蛋白质结构域，如有必要，我们将根据生物信息学预测的二级结构，对蛋白质表面上一些氨基酸进行突变和修饰，以增加蛋白质的可溶性和稳定性。
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