主要目标
利用高通量选择的方法，选择出对乙酰基赖氨酸，甲基赖氨酸，荧光氨基酸或具有光交联活性的氨酰-tRNA合成酶，并将这项技术用于甲基化、乙酰化后的核小体制备和结构研究，以及表观遗传调控的分子生物学研究。
承担单位
中国科学院生物物理研究所，复旦大学
课题负责人
王江云
主要学术骨干
季朝能、陈澍
经费比例
课题六、针对表观遗传关键蛋白的药物设计
表观遗传学是研究非遗传序列改变所引起的基因表达水平的改变。目前所知的也是研究得较为深入的表观遗传调控分子机理包括DNA甲基化和组蛋白翻译后修饰（包括甲基化，乙酰化，磷酸化，SUMO化，糖基化等)。组蛋白赖氨酸的N端乙酰化或去乙酰化修饰可改变染色质的区域结构。组蛋白的赖氨酸残基的乙酰化和去乙酰化会改变核小体的电荷，也会影响与核小体重构复合体（Nucleosome remodeling complex）的相互作用，进而形成一种开放的或紧密的染色质结构。一旦肿瘤抑制基因受到组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的作用，其基因转录将受到抑制，从而引起肿瘤发生。因此HDAC抑制剂可杀伤肿瘤细胞。许多组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶也在多种癌症发生中起重大作用，因而也被日渐意识到是抗癌药物研发的重要靶点。
表观遗传学从理论提出到临床尝试花费了约15年的时间，为肿瘤的发生机制的认识提供了新角度和新知识，表观遗传学的干预药物在临床上的有效性则提示表观遗传学理论的正确性，并为肿瘤治疗提供了新的重要靶点，为肿瘤治疗提供了新的方法。DNMT和HDAC已经被证明是肿瘤治疗的重要靶点，但一些已知抑制剂的药物性质经临床试验还不是很理想，其作用效果尚待提高、机制有待阐明。 因此，人们在寻找有效而毒性低的抑制剂。
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主要研究内容
尽管有关靶向HDAC的抑制剂方面的研究已有可喜成绩，例如已在国外进行临床试验的抗癌的HDAC的抑制剂的研制，但由于目前这些抑制剂固有的限制，例如较大的细胞毒性等，限制了其进一步临床应用。当前，研制新型的具有我国自主知识产权的表观遗传学小分子抑制剂十分必要和迫切，而且具有重要的战略意义。小分子化合物因为能够自由通透细胞，可有效干预生物大分子和生物大分子之间，生物大分子和DNA之间的相互作用，其优点包括：作用快速、呈剂量依赖性、可逆性。因此小分子化合物成为表观遗传学研究和靶点药物开发的重要手段和策略。近十几年，经吸收组合化学方法逐渐发展起来化学生物学，大大提高了研制新型小分子化合物的效率，可以同时批量合成小分子化合物。
本课题的主要研究内容有：筛选具有良好药物性能的HDAC抑制剂、与本项目的其它课题组合作，利用结构生物学和化学方法改善和优化通过筛选得到的抑制剂、利用本项目各课题组的优势，合作开展组蛋白甲基转移酶、去甲基化酶、泛素化连接酶和去泛素化酶的小分子抑制剂筛选工作。
(1) 筛选具有良好潜在药物性能的HDAC抑制剂先导化合物:
HDAC是国际上公认的基于表观遗传调控的抗癌药靶。我们将充分结合本项目的结构生物学和化学生物学的强项，同时进行理性的和基于化学小分子文库的针对表观遗传学关键靶蛋白的抑制剂设计和筛选。我们已在前面的技术路线里提到用四种途径初步筛选出一系列的候选小分子：1）基于蛋白质结构的计算机虚拟筛选；2）基于化学小分子文库的高通量药物筛选；3）基于靶蛋白结构，合理设计针对性强的、结构新颖的小分子抑制剂；4）对于已知的小分子抑制剂作结构和性能改良。对于以上途径所得到的候选小分子抑制剂的生物活性检测、筛选出确能靶向抑制HDAC的化合物、同时又具有抗肿瘤活性是决定它们是否能成为有效的药物侯选者的关键。我们有这方面丰富的经验，具体的步骤见下：
a）组蛋白去乙酰化的测定
通过对组蛋白乙酰化测定观察这些化合物对HDAC8的抑制效应。组蛋白去乙酰化
的测定有成熟的方法，例如用带有荧光基团的乙酰化组蛋白多肽作为底物进行监测。
b）测定先导化合物对肿瘤细胞的增殖的影响：
将不同浓度的化合物加入细胞培养体系，通过MTT法测定OD值，计算IC50；通
过FACS测定细胞周期分布的影响
c）测定先导化合物对肿瘤细胞的存活/死亡的影响: Trypan blue, Annexin V-FITC, 细胞自噬测定
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d）明确先导化合物对肿瘤细胞的增殖、死亡信号转导通路的影响；
e）分析先导化合物抑制肿瘤细胞的增殖、杀伤肿瘤效应与抑制表观遗传学靶酶的相互关系。
f）对于有苗头的小分子化合物进行在体测试：主要利用裸鼠皮下抑制瘤模型、小鼠白血病模型，并观察其毒副作用。
（2）表观遗传学化学调控与其它信号转导靶点干预的相互关系
肿瘤是由多打击、多步骤引起的复杂过程。表观遗传导致肿瘤抑制基因的沉默被认为肿瘤发生的重要方面；另一方面，酪氨酸激酶因突变等原因引起的激活也是肿瘤发生的重要机制。而在某些肿瘤例如在慢性粒细胞性白血病，表观遗传学的异常和酪氨酸激酶的活化则是同时存在的，因此，它们对于肿瘤的发生发展可能协同作用，在不同方面、不同时期有所侧重。传统的观点认为酪氨酸激酶JAK通过激活转录因子STAT3和STAT5引起肿瘤，但新近报道酪氨酸激酶JAK可以破坏异染色质组件HP1(heterochrmatin protein 1)和Su(var)3-9基因的沉默而促进肿瘤而不必通过STAT途径。（Shi S et al. Nature genetics,2006;38:1071-1076）。关于JAK2的另一个研究则提示SOCS1的超甲基化是JAK2 V617F突变导致肿瘤机制的重要补充（Jost E et al. Leukemia. 2007 Mar;21(3):505-10）。Yang 等发现阻断酪氨酸激酶c-KIT可以使致瘤基因MAGE启动子发生甲基化而使之失活（Yang B et al, Epigenetic control of MAGE gene expression by the KIT tyrosine kinase. J Invest Dermatol. 2007 Sep;127(9):2123-8）.这说明表观遗传与酪氨酸激酶的活化有千丝万缕的联系。同时，把两种治疗策略加以联合是否可以取得更大疗效，则很值得在基础研究领域加以探讨。
我们将研究：
用酪氨酸激酶特异性抑制剂阻断信号转导在相关肿瘤细胞和白血病病人原代细胞标本是否可以引起表观遗传学的改变。
酪氨酸激酶小分子抑制剂（例如STI571,AMN107,Nilotinib等）的研究在过去的十年里取得了长足进展，有数个小分子药物获得FDA批准应用于临床，并获得了较好的疗效。我们具有c-KIT D816V突变和 c-KIT V560G突变的引起白血病的细胞模型，也具有新型c-KIT酪氨酸激酶小分子抑制剂EXEL-0862。我们用EXEL-0862，STI571,AMN107,Nilotinib等酪氨酸激酶小分子抑制剂处理c-KIT D816V突变和 c-KIT V560G突变细胞，系统检测表观遗传学的改变（包括Global甲基化改变和与该种白血病密切相关的肿瘤基因和肿瘤抑制基因的甲基化修饰情况）。
其他模型包括Bcr-Abl,PDGFRa，Jak2突变引起的白血病,将使用相应的特异性酪氨酸激
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酶小分子抑制剂。
用小分子化合物VX-680抑制aurora的活性后，检测组蛋白修饰的可能变化。探讨VX-680抑制肿瘤生长是否跟组蛋白修饰的变化有关。
探讨临床试验上十分棘手的STI571获得性耐受是否与肿瘤细胞的表观遗传学有关。 2）表观遗传干预药物与酪氨酸激酶抑制药物的联合应用抗肿瘤策略的探讨
由于表观遗传学和酪氨酸激酶突变在肿瘤发生发展过程中可能从不同侧面起作用，因此，联合应用这两个方面的小分子抑制剂可能有协同作用。我们将利用本项目所研制的表观遗传学抑制剂和已有的抑制剂，通过联合酪氨酸激酶抑制剂，探讨这两种抗肿瘤策略是协同抑制肿瘤。从细胞生物学和分子生物学角度探讨这种协同效应的基础。
主要目标
从已知化合物文库中筛选出2?4个对HDAC活性有抑制作用的小分子化合物；用计算机辅助设计，合成，得到一组结构全新的、针对HDAC小分子抑制剂；并进行结构修饰和优化，预期得到先导化合物。为进一步把靶点药物研发奠定基础，同时所得到的先导化合物也可应用于表观遗传学的化学调控研究。建立表观遗传干预与酪氨酸激酶的阻断联合应用抗肿瘤策略的分子药理学基础。
承担单位
中山大学，中国科学院生物物理研究所
课题负责人
潘景轩
主要学术骨干
许芳，齐财
经费比例
14%
6、各课题间的相互关系
本项目的六个课题包括了对于组蛋白甲基转移酶/去甲基化酶、乙酰转移酶/去乙酰化酶的结构和功能研究(课题一) ；组蛋白泛素化连接酶/去泛素化酶的结构和功能研究(课题二) ；高精度电镜方法在大组蛋白修饰酶复合体结构及染色质高级结构研究中的应用(课题三) ；组蛋白磷酸化调控以及与蛋白质-蛋白质相互作用研究(课题四) ；化学生物学方法在表观遗传学研究中的应用(课题五) ；基于组蛋白修饰酶的药物设计和开发(课题六)。由此可
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见，本项目的课题设臵是沿着一条组从组蛋白修饰到染色质高级结构研究这样的主干路线（课题一至四），并且在大力利用成熟的结构生物学方法的同时高度重视发展和利用新的研究方法（课题五）以及表观遗传学研究的重要应用（课题六）。这些课题的高度相关性会促使课题间的紧密合作。例如课题一、三、五、六之间的合作会利用组蛋白修饰酶的结构信息、合成和制备修饰过的核小体、进行染色质高级结构的探索和蛋白修饰酶的小分子干扰剂研制。其次，组蛋白泛素化是一些组蛋白赖氨酸甲基化的先决条件，而Ｈ3Ｓ10的磷酸化直接抑制Ｈ3Ｋ9的甲基化。这些表观遗传学的相互依赖的关系也有机地结合了课题一、二、四。总之，本项目的六个课题相对的独立，而相互之间又有天然的有机关系。相互之间的合作将极大地提高本项目的整体研究水平。
6、项目总体目标和五年目标的关系
本项目的总体目标是使我国在表观遗传学的结构机理研究水平跻身于国际先列。其中的一项主要长远目标是在表观遗传学机理研究领域做出几项有标志性的工作；这包括在组蛋白修饰酶的复合体结构，蛋白质和核小体的复合体结构，以及异染色质(heterochromatin)的三维结构研究方面有所突破。项目的五年目标为总体目标提供了以下基础：1) 提供复杂的组蛋白修饰酶复合体和核小体的制备技术；2) 为解决总体目标中的重大科学问题提供多学科合作的经验和平台；3) 所得到的结构和功能信息将为总体目标中的实验设计提供新思路；4) 为项目总体目标的实现培养出一支训练有素、勇于探索的年青研究队伍。
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