四、年度计划
研究内容 克隆、表达和纯化有关的组蛋白修饰酶及其调控蛋白，并开展蛋白质结晶初始条件的探索。合成用于体外制备修饰后的核小体的氨基酸；构建和完善核小体制备技术。构建以线虫发育为模式的表观遗传学功能研究平台。对已知的HDAC8结构进行分析，并用之于HDAC抑制剂的计算机辅助筛选。 预期目标 成功地表达20个以上可溶的组蛋白修饰酶和其调控蛋白，并进行分离纯化和结晶条件筛选。争取得到5-10个蛋白质晶体的初步生长条件。实现以较低成本合成修饰后的非天然氨基酸，完善核小体制备技术。得到组蛋白修饰异常的线虫株。用计算方法筛选出几十至几百个HDAC的候选小分子抑制剂。 第 一 年 第 二 年 优化在第一年所得到的初始结晶条件、收集晶体的衍射数据和解析晶体结构。进一步改善其余蛋白质的表达和纯化条件，继续蛋白质结晶初始条件的筛选工作。开始组蛋白修饰酶复合体的纯化和结构研究的初始工作。开展核小体与组蛋白修饰酶相互作用的分析和复合体的纯化工作。构建氨酰-tRNA合成酶突变库，并对目标非天然氨基酸进行高通量筛选。分析发育异常的线虫株中的组蛋白修饰状态。提出对HDAC候选小分子抑制剂的改造方案，并对部分已知HDAC8抑制剂进行结构改造。探讨表观遗传干预药物与酪氨酸激酶抑制药物的联合应用抗肿瘤策略。 完成5-10个晶体的结构解析并且利用所得到的结构信息来构建突变型组蛋白修饰酶及其调控蛋白。验证由结构所预测的这些组蛋白修饰酶的作用机理。筛选出3-5个组蛋白修饰酶复合体的结晶条件。得到适合与晶体学和冷冻电镜研究的核小体和其它蛋白质复合体样品，并开展初步的三维结构研究。筛选并验证得到只对有关非天然氨基酸有专一性的氨酰-tRNA合成酶。完成对TSA等HDAC潜在广谱类抑制剂进行结构改造的理性设计和化学反应工作，并且对候选小分子抑制剂进行实验验证。初步揭示表观遗传干预与酪氨酸激酶的阻断联合应用抗肿瘤策略的分子药理学基础。 30
研究内容 优化组蛋白修饰酶复合体的初始结晶条件、收集晶体的衍射数据和解析晶体结构。开始基于结构信息的蛋白质-蛋白质相互作用及其在酶活性调控中的作用的功能研究。继续其余的组蛋白修饰酶复合体的纯化和初始结晶条件的筛选工作。寻找核小体与组蛋白修饰酶的复合体的晶体生长初始条件和开始较高精度的冷冻电镜研究。开展组蛋白修饰酶及相应的组蛋白修饰状态在线虫发育过程中的定位分析。开始制备含修饰后的组蛋白的核小体。对结构改造而获得的新颖的HDAC抑制剂进行进一步的生物活性检测，并对HDAC化学小分子文库进行高通量药物筛选。 解析组蛋白修饰酶复合体的晶体结构，并且结合生物化学和其它生物物理学方法来揭示这些组蛋白修饰酶的反应机理及活性调控机制。利用结构信息开展小分子预期目标 完成3-5个组蛋白修饰酶复合体晶体的结构解析并且揭示蛋白质-蛋白质相互作用影响酶活性的结构机理。得到3-5个新的组蛋白修饰酶复合体的初始结晶条件。筛选出1个核小体与组蛋白修饰酶复合体的结晶条件，得到一个较高精度的组蛋白修饰酶复合物的电镜结构。掌握制备带甲基化的组蛋白的核小体的体外重组技术。获得一组由基于结构信息改造的结构新颖的HDAC抑制剂和从化合物文库中筛选出2?4个对HDAC活性有抑制作用的小分子化合物预期得到先导化合物，并对它们的生物活性进行分析。 第 三 年 第 四 年 抑制剂的筛选工作。优化核小体与组蛋白修饰酶的结晶条件，以期得到衍射性能优良的晶体。分析带甲基化组蛋白的核小体与蛋白质的相互作用，寻找适合于冷冻电镜和共结晶分析的核小体-蛋白质复合物。揭示线虫不同发育阶段的染色质纤维局部二级结构的三维构像。继续进行基于化学小分子文库的高通量药物筛选，并对候选化合物进行生物活性检测和临床前研究。 完成有关组蛋白修饰酶复合体的晶体结构解析工作。筛选出2-4个具有良好特性的药物先导物，研究候选化合物是否具有抗肿瘤作用，及其抗肿瘤作用是否与其抑制HDAC的作用直接相关。收集核小体与组蛋白修饰酶复合体的晶体衍射数据。开始染色质高级结构的分析工作。 31
研究内容 解析核小体与组蛋白修饰酶复合体的晶体结构。开展药物先导物与组蛋白修饰酶结合的结构研究工作，为改良药物先导物的药理性质提供结构依据。结合晶体学和冷冻电镜方法来研究核小体与其识别蛋白的相互作用模式及其所形成的高级结构。 预期目标 完成一个核小体与组蛋白修饰酶复合体的晶体结构。揭示更多的组蛋白修饰酶的结构和功能关系。提供基于结构信息的有关药物先导物的改良方案。初步揭示染色质高级结构的三维构像。 第 五 年
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