（1）组蛋白甲基转移酶的产物和底物特异性。
有些甲基转移酶可以做单甲基化，而另一些酶可进行多甲基化。不同状态的组蛋白甲基化在细胞里起到的表观遗传调控作用效果大不相同。已有一些研究证明有些酶的活性中心的大小的细微变化，例如一个苯丙氨酸与酪氨酸的区别，就能影响到甲基转移酶的产物特异性。但是在体内不同状态的甲基化是由不同的甲基转移酶或者由不同组份的甲基转移酶复合体完成的。本课题将着重研究H3K4和H4K20的多甲基化分子机理。我们选择这两个位点的多甲基化机理研究的一个原因是它们的单甲基化酶，Set7/Set9和Set8的三维结构已被解析，而它们的多甲基化酶PRDM7/PRDM9和Suv4-20的结构信息还一无所知。我们将结合X光晶体学和生物化学的手段来揭示这两个多甲基化酶的分子机理，包括活性中心组份和结构、以及产物特异性决定因素。比较单和多甲基化酶的活性中心结构差异，并利用这些差异来设计能区分单和多甲基化酶的小分子抑制剂，这将是一件十分有意义的表观遗传学的生物技术和医学应用。
组蛋白甲基化酶和去甲基化酶具有高度的底物特异性，而目前只有一部份的甲基化酶和极少数的去甲基化酶与其底物结合的特异性得到了阐明。在以上的PRDM7/9和Suv4-20的结构研究中，我们还将利用所得到的结构信息进行定点突变和共结晶研究，目的是揭示这些酶的底物特异性的决定因素。另外有一类组蛋白甲基转移酶不识别孤立的短肽片段而需要整个核小体作为底物，已知的例子包括H3K27，H3K36和H3K79的甲基转移酶。蛋白质与核小体复合物的结构研究难度较大，而且在国际上还研究得很少。这也是我们希望作为领先国际研究水平的一个突破口。所以，本子课题的一项内容就是开展核小体的制备工作并用之于与组蛋白质修饰酶或其它蛋白的共结晶。
（2）组蛋白甲基化酶的调节
组蛋白修饰酶的活性调控机理结构研究在国际上还是空白，填补这项空白、促进这方面的研究壮大发展是本项研究的一个重要目标。有的组蛋白修饰酶在单体时不具有活性或者只有很弱的活性，而与其它蛋白结合后其酶活性就被激活了或者大大提高了。这种酶活性调控机制是细胞内表观遗传调控的一种体现，具体的例子包括：大部分组蛋白去乙酰化酶，如HADC1-3与含WD40 repeat和SANT结构域的蛋白质的相互作用，SIR2与SIR4的相互作用等；一部分乙酰转移酶，例如酵母中的Hat1与Hat2以及 Sas2与Sas4-Sas5的相互作用；本子课题集中研究一部分重要甲基转移酶的调控，而且这研究思路也贯穿到后面的对组蛋白去甲基化酶和乙酰化/去乙酰化酶的研究。我们选择MLL复合体作为对甲基转移酶调控研究
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的标本。MLL复合体的中心组份包括MLL，WDR5，RBBP5和ASH2L。其中MLL是H3K4的催化亚基，但它单体并没有活性。MLL与WDR5和RBBP5结合后的复合体具有H3K4双甲基化的活性，而再与ASH2L结合后就能使H3K4三甲基化。我们的目标是寻找以下两个重要问题的答案：1) WDR5和RBBP5的结合是如何激活MLL的酶活性的？2)ASH2L是怎样使MLL复合体作H3K4三甲基化的？由于MLL在许多白血病发生中有很大的作用，而且是在真核细胞进化过程中保守的Trithorax蛋白的代表，其结构机理的研究具有深刻的科学意义和可观的应用前景。
二、组蛋白去甲基化的结构机理研究
组蛋白去甲基化酶是否存在曾经长时间困扰着表观遗传研究。现在已知的去甲基化酶包括LSD1和一大批含JMJC结构域的蛋白质。组蛋白去甲基化酶的结构研究才刚刚起步，目前已知结构的组蛋白去甲基化酶仅有LSD1和JMJC家族中的JMJD2A和JHDM1。还有很多的去甲基化酶的结构和反应机理有待解析。本课题的主要研究内容是以蛋白质X射线晶体学方法为主要研究手段，结合其它生物物理和生物化学方法，深入研究组蛋白去甲基化酶的结构及其复合物：
(1) 组蛋白去甲基化酶的催化核心结构以及与甲基化多肽的复合物结构
组蛋白去甲基化酶的结构研究才刚刚开始，还有许多非常重要的问题并不清楚，很多组蛋白去甲基化酶的结构和反应机理还有待解析；到目前为止，去甲基化酶识别其对应的赖氨酸的机理还不太清楚。除了已经解出结构的组蛋白去甲基化酶外，我们准备接着研究其它几类组蛋白去甲基化酶具有酶活性的核心结构，如JHDM2、SMCX和JMJD3家族等。我们将着重研究H3K4、H3K36、H3K27和H3K79去甲基化酶结构和复合物结构。通过复合物的结构研究组蛋白去甲基化酶的催化反应机理和底物特异性。
(2) 组蛋白去甲基化酶与蛋白质的相互作用
大部分组蛋白去甲基化酶，都能与一些蛋白质形成复合物，如LSD1，JHDM2、JMJD2家族蛋白可与雄性激素受体形成复合物。它们在疾病的产生中起着重要的作用。有些组蛋白去甲基化酶，如LSD1，单独就具有酶活性；而与其它蛋白质如雄性激素受体形成复合体后酶活性发生改变。还有一种情况就是复合体的形成可大大地提高了酶活性。组蛋白修饰酶复合体里亚基之间的相互作用是怎样激活或者提高组蛋白修饰酶的活性的结构机理研究在国际上到目前为止还是空白，这也是本项研究的重点。
我们也将与本项目的其它课题组合作，开展基于组蛋白去甲基化酶结构的药物设计工
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作。很多组蛋白去甲基化酶在重要疾病如癌症等的发生中起着关键的作用，如KDM5B去甲基化酶在乳腺癌，KDM4在食管癌、胃癌和前列腺癌等重大疾病中都有关键的作用。我们将利用本课题所得到的结构信息结合计算生物学和化学生物学的方法进行药物设计、抑制剂的寻找等初期研究。
三、组蛋白乙酰化/去乙酰化酶复合物的结构研究
组蛋白乙酰化/去乙酰化修饰是由多个蛋白组成的组蛋白乙酰化酶复合物作用于组蛋白上的赖氨酸来完成的。多个组蛋白乙酰转移酶的催化亚基的结构已得到解析，所以本课题将聚焦在复合体里蛋白质-蛋白质相互作用的结构和功能研究。我们选择三个有不同结构复杂性的复合物，包括Hat1-Hat2双聚体，Sas2-Sas4-Sas5三聚体和多组份的NuA4，作为我们的切入点进行这方面的研究。
在Hat1-Hat2双聚体里，已知三维结构的Hat1是催化亚基。Hat2是一个WD40-repeat蛋白。它与Hat1的结合使得复合体的酶活性比Hat1单体的活性提高上千倍，而其中的结构机理一无所知。这也是本课题研究期望回答的问题。其次，Sas2是Sas2-Sas4-Sas5复合体中的催化亚基。它与Sas4的结合是整个复合物酶活性的先决条件，而Sas5的加入极大地提高了这个乙酰转移酶复合物的酶活性。研究这三个蛋白质之间的相互作用对于这个复合物的酶活性的影响是本课题研究的另一项内容。
组蛋白乙酰化在激活基因表达中的作用与以ATP为燃料的核小体重构复合体(Nucleosome Remodeling Complex)的作用是分不开的，但人们对于这两个过程是如何紧密的耦合在一起的理解还极其有限。本课题重点以组蛋白乙酰化酶（HAT）复合物NuA4以及核小体重构复合物SWR1共享的Yaf9p和Swc4p为主要研究对象，开展对组蛋白修饰与染色体重构在基因表达调控中的关系的结构机理探讨。NuA4是一个较为重要的乙酰化酶复合体，其主要组份为Act1p, Arp4p, Eaf3p, Eaf5p, Eaf6p, Eaf7p, Epl1p, Esa1p, Swc4p,Tra1p,Vid21p,Yaf9p,Yng2p等蛋白质。NuA4 HAT复合物能在生物体内催化组蛋白H4第5位，第8位，第12位，第16位赖氨酸的乙酰化反应，并且进一步的研究表明：组蛋白H4上述位点的乙酰化赖氨酸对特定基因具有转录激活作用。在该复合物众多的蛋白质组分当中，仅Esa1p具有组蛋白乙酰化酶的催化活性，其余的蛋白质组分在实验过程中发现为该乙酰化酶复合体发挥生物学活性所必须。此外，Yaf9p以及Swc4p同时还存在于核小体重构复合物SWR1当中。SWR1复合体在基因的转录过程中催化组蛋白H2A与组蛋白类似物H2A.Z在细胞核内的臵换反应，使其形成含有特殊核小体的染色质结构，从而维持基因表
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达转录的水平。对于Yaf9p以及Swc4p是如何协调两种具有不同生物学功能的蛋白质复合体在复杂生物体内实现生物学反应的时间－空间顺序的结构机理的探讨是本课题研究的另一项内容。有意思的是，该复合物中的Yaf9蛋白质的结构根据预测为一种全新的折叠类型。搞清楚这一种折叠类型的蛋白质是否在基因表达和调控中有类似的功能也是非常有意义的。
主要目标
本课题的预期目标是在以上的每个方向里做出有代表性的结构工作，并且利用所得到的结构信息进行深入的生的化和体内功能研究。我们总体上期望解析5个以上新组蛋白修饰酶复合物结构，并利用所得到的结构信息对这些组蛋白修饰酶进行进一步的功能研究。所得到的蛋白质结构也将用于小分子干扰剂的发现和设计。由于H3K79，H3K27，H3K36，H4K20甲基转移酶hDot1，EZH2，Set2和Suv4-20的底物是核小体，所以我们也将开展核小体的制备和与核小体结合的复合体的研究。
承担单位
中国科学院生物物理研究所，中国农业大学
课题负责人
许瑞明
主要学术骨干
陈忠周、吴玮、赵武玲、许航、曾宗浩
经费比例
课题二、组蛋白泛素化的结构基础
组蛋白泛素化连接酶和去泛素化酶在DNA损伤修复、基因的转录调控以及mRNA转运过程中起着重要的作用，也是国际上表观遗传学研究的热点之一。但是目前国际上还没有人开展专门对组蛋白的泛素化连接酶、去泛素化酶及其与调控蛋白质的单体和复合物结构测定以及基于结构的调控机理研究。组蛋白的泛素化在DNA的辐射损伤和断裂损伤信号途径中起着重要的作用，DNA受到紫外照射后会发生胶连反应，在DNA产生紫外照射损伤后，组蛋白H3、H4的泛素化连接酶DDB－CUL4－ROC1能使组蛋白H3、H4泛素化，使DNA与组蛋白分离，因此其它DNA损伤修复蛋白能与DNA结合，行使修复功能。而当DNA产
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生断裂损伤后，组蛋白H2AX的泛素化连接酶RNF8-UBC13能使其泛素化，然后招募其它的DNA损伤修复因子如53BP1、BRCA1、Rap80到断裂位点，行使修复功能。组蛋白泛素化连接酶复合物DDB1－CUL4－ROC1和RNF8－UBC13在不同的DNA损伤修复过程中起着重要的调控作用，测定这些组蛋白泛素化连接酶的单体和复合物的三维结构，对于了解这些组蛋白泛素化连接酶复合物的分子组装机制，复合物中各个亚基间的相互调控作用机理，以及其在DNA损伤修复过程中的作用机理有重要的意义。
组蛋白去泛素化酶在基因转录的激活、沉默以及mRNA转运途径中起着重要的调节作用。其中功能研究较多的是酵母组蛋白去泛素化酶UBP8和UBP10，而酵母作为一种模式生物，研究其蛋白的结构和功能对于研究此类蛋白在其他真核生物中的作用有着指导意义。UBP10能使端粒区的组蛋白H2B去泛素化，抑制端粒区基因的表达。除了使端粒区的基因沉默外，UBP10也能调控其它区域的基因表达。UBP8能使转录激活区的H2B去泛素化，激活基因转录。UBP8还能通过sgf11以及sus1与mRNA转运途径相联系，调控mRNA的转运。目前mRNA转运与表观遗传修饰调控蛋白复合物之间的联系机制还不清楚。测定这些组蛋白去泛素化酶及其与调控蛋白质复合物的结构，对于深入理解组蛋白去泛素化酶在基因转录和mRNA转运过程中的调控机理有着指导意义。
主要研究内容：
（1）在DNA损伤修复过程中起重要作用组蛋白泛素化连接酶及其调控蛋白单体的结构和功能研究
DNA损伤修复与衰老、肿瘤发生、辐射效应等都有密切的关系。人类遗传性疾病已发现4000多种，其中不少与DNA修复缺陷有关。DNA损伤速率大约是每个细胞每天50,000至500,000处分子损害，如果一些关键的癌基因受到未修复的损伤将给机体带来灾难性的后果，因此DNA损伤一直以来也是癌症研究的一个重要方面。虽然这方面的研究很多，但是对DNA损伤应答的分子机制特别是对这些DNA损伤应答途径中调控蛋白质及其复合物的结构仍然所知甚少。组蛋白的泛素化在DNA的辐射损伤和断裂损伤信号途径中起着重要的作用，例如在受到紫外照射后，组蛋白H3、H4的泛素化连接酶DDB1－CUL4－ROC1能使H3、H4泛素化，使组蛋白和DNA间的分离，协助DNA修复蛋白能结合到受损伤的DNA位点行使修复功能。CUL4－ROC1的底物很多，例如组蛋白H3、H4、P53等，目前其底物特异性决定因素仍然是研究的热点之一，有研究显示含有一类WD40－repeat motif的蛋白在CUL4－ROC1的底物识别过程中起着重要作用，但是还没有CUL4－ROC1和此类蛋白的复
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