为进一步进行基于结构基础上的药物设计提供理论基础及前期积累。本课题主要包括以下2个主要内容：
组蛋白磷酸化的调控机理研究
组蛋白H3氨基末端的磷酸化修饰是染色质活性调节的重要事件。组蛋白H3 Ser-10 残基的磷酸化修饰在细胞间期和有丝分裂期有着相反的生物学效应，在间期H3的 Ser-10磷酸化由于促进邻近赖氨酸的乙酰化而激活邻近染色质位点基因的转录，而在G2 向M期的过渡期及有丝分裂早期（prophase）染色质中组蛋白H3 Ser-10 残基实现整体的磷酸化，导致染色质的整体性凝集，为两套基因组染色体在赤道板的排列和正确分离准备条件，因此组蛋白H3 Ser-10 磷酸化被看成有丝分裂的标志性事件。有实验证据表明组蛋白H3 Ser-10 磷酸化是由进化上非常保守的一组激酶aurora激酶中的aurora B催化的。显然aurora B的活性是受到严格的调节的。在动物有丝分裂细胞中的中期、后期和末期，aurora B先分布在染色体臂而后转移到着丝粒，再转移到纺锤体中区再到中体。在这个过程中aurora B与蛋白INCEP, Survivin, Borealin结合形成染色体过客复合物（Chromosome Passenger Complex, CPC）一起从染色体进入细胞质。以aurora B激酶为核心的这个蛋白质复合物在染色质凝集、染色体在赤道板的正确排列和分离、中体（midbody)的成熟及胞质分裂等这些过程的成功进行都是不可少的。Aurora B 在细胞中使CPC复合物中的INCENP，Survivin和Borealin 磷酸化。它的活性和细胞内定位受这几个蛋白的调节。它们的基因缺失或突变可使Aurora B 失活。我们已有的工作表明CENP-A 蛋白、ser10 磷酸化组蛋白H3和aurora B有类似的行为，均能从染色体转移到纺锤体再到中体，凝集成特殊结构复合物组成中体支持细胞完成胞质分裂。鉴于auroraB在表观遗传学中的功能和调节尚不清楚，为了深入了解aurora B激酶磷酸化组蛋白对细胞间期基因表达的调节，了解在有丝分裂期其活性的调节，以及CPC复合物形成的分子机理和调控机制。我们将利用免疫沉淀法从同步化细胞中分别抽提不同细胞相期和aurora B结合的蛋白复合物。分析这些复合物中蛋白质的种类和结构状态（包括修饰状态）以便区别细胞间期和中期aurora B的结构状态和调节因子、调节方式；克隆CPC复合物中的相关蛋白基因，分离纯化表达产物，用X射线晶体学和核磁共振研究蛋白结构及功能；以及用生化和分子生物学手段如RNA干扰等手段研究相关aurora B调节因子的功能。同时我们将与医院临床进行合作研究，探讨某些重要蛋白在疾病的临床确诊和治疗方面的可能性。
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（2）参与表观遗传调控的含PDZ结构域蛋白质家族的结构与功能研究
PDZ结构域可以与一系列蛋白相结合并调控其生物学功能。这些PDZ结构域结合蛋白包括一系列受体（例如G蛋白结合受体和酪氨酸激酶受体），离子通道（例如钠离子、钾离子和钙离子通道），细胞粘着蛋白（例如钙粘着蛋白和多配体蛋白聚糖），神经递质转运蛋白（例如多巴胺和5-羟色胺转运蛋白），微管动力蛋白（例如驱动蛋白和动力蛋白）以及许多信号传导酶。近来人们通过蛋白质组学、酵母双杂交等方法，发现在组蛋白修饰过程中有很多包含PDZ结构域的蛋白参与，例如激酶PBK/TOPK（PDZ-binding kinase/T-LAK cell-originated protein kinase）通过磷酸化组蛋白H3来调节细胞的生长，PBK/TOPK激酶在妇女乳腺癌细胞中过量表达。在其C末端含有一个PDZ结合序列，因此PBK/TOPK参与组蛋白修饰的调控可能通过PDZ蛋白来实现；支架蛋白Pro-IL-16含有三个PDZ结构域，通过PDZ-配体相互作用，Pro-IL-16与转录因子GABP?1(GA binding protein ?1 subunit)和组蛋白去乙酰化酶HDAC3(histone deacetylase 3)形成蛋白复合物来调节Skp2在T细胞中的转录活性；T细胞特异性转录因子SATB1(special AT-rich binding protein 1)可以与CBP/300和组蛋白乙酰化转移酶PCAF相结合。SATB1与PCAF的结合将使SATB1中的PDZ结构域被PCAF乙酰化，从而导致SATB1不能与DNA相结合，但CBP/p300与SATB1没有相应的效应。然而这些PDZ结构域蛋白参与调节组蛋白修饰过程的分子机理尚未清楚，为了揭示PDZ结构域蛋白参与组蛋白修饰过程的分子机理及调控机制，在本课题中我们将利用信息生物学的方法找到参与组蛋白修饰的所有包含PDZ结构域蛋白，作为我们的研究对象来研究PDZ结构域及其蛋白参与组蛋白修饰过程的分子机理和调控机制，同时我们也将关注一些特殊的PDZ蛋白（如Tip-1等）在参与表观遗传调控过程中的分子机理。如此系统的研究将填补目前国际国内一片空白的局面。目前我们已经完成了对鼠源TIP-1基因的克隆、表达纯化、结晶和结构的初步分析；PBK/TOPK已从乳腺癌组织克隆，现正在进行下一步实验，同时我们将对其它基因（如Pro-IL-16、SATB1等）进行克隆尝试。由于在很多疾病中，组蛋白修饰表现出异常，因此我们的研究将与医院进行合作来探讨PDZ蛋白参与临床确诊及治疗的可能性。我们希望通过解析这些PDZ结构域或其复合物精细的三维结构，系统地研究PDZ结构域家族蛋白参与组蛋白修饰过程的调控机理，从分子水平上阐明PDZ蛋白参与组蛋白修饰过程的工作机制。希望能在某些PDZ结构域家族蛋白上找到药物靶点的切入点，为设计小分子药物来预防及治疗其参与的肿瘤和癌症及重大遗传病提供前期理论基础。
主要目标
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本课题的预期目标是在以上的研究内容里的每个方向得到几个原创性的重要蛋白的结构工作，通过解析这些蛋白质的三维结构，在原子分辨率水平上揭示这些蛋白与蛋白或蛋白与底物之间的相互作用力，并利用其它的实验手段来研究结构与功能的关系，从而揭示aurora B激酶在有丝分裂期活性的调控机制及CPC复合物的作用机理和阐明PDZ蛋白参与调控组蛋白修饰过程的一般规律。同时也将探索一些重要调控蛋白与一些重大疾病的潜在关系，并结合生物化学或其它物理、化学、细胞的手段来了解它们的功能和与本项目的其它课题组合作，来寻找潜在的药物结合靶点的切入点，并进行以结构为基础的药物设计。
承担单位
南开大学，天津科技大学
课题负责人
龙加福
主要学术骨干
黄熙泰、张同存
经费比例
课题五、表观遗传学的的化学生物学研究
表观遗传学的研究包含组蛋白的共价修饰和DNA甲基化，这些过程不仅在生物学上具有重大意义，化学反应的机制也非常复杂和有趣。例如，组蛋白的乙酰基化酶和甲基化酶分别需要乙酰辅酶A和S-腺苷甲硫氨酸。组蛋白去乙酰基酶分为两类，一类是含有锌离子的经典水解酶（HDACs），另一类含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Sirtuins)，去乙酰基的同时水解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。 去甲基化酶有一种需要核黄素(LSD), 去甲基的同时产生甲醛和双氧水；有一种需要二价铁（JHDM），去甲基的同时产生甲醛。组蛋白的共价修饰在化学上的丰富多彩和复杂性决定了化学生物学的方法将提供研究表观遗传学的重要工具，结合结构生物学的方法，将对解决有关表观遗传的组蛋白修饰研究的主要问题作出重要贡献。同时，我们也将通过这一项目的启动，推动化学生物学和结构生物学在我国的紧密结合，并培训一批化学生物学方向的青年骨干人才。
化学生物学的一个重要的前沿方向是用基因编码的非天然氨基酸作为探针，研究信号转
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导和酶的催化机制。通过人工的方法可以增加用来编码非天然氨基酸的新遗传密码。首先把无义密码“UAG”确定为新的遗传密码，然后对天然的转运核糖核酸（tRNA）突变, 使其含有反密码子“CUA“。在此基础上从氨酰-tRNA合成酶突变库中，筛选出可专一结合这种tRNA和指定非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶突变体。在这之后，再将生命体中mRNA 上任意一个遗传密码取代为UAG, 并在培养基中加入化学合成的非天然氨基酸，就可以在蛋白质中相应的位臵插入有特殊物理、化学性质的氨基酸, 从而在生物活体内对信号转导过程进行精确研究；并且可以大量表达在指定位点含有非天然氨基酸的蛋白质，进行结构生物学或酶学机理研究。这种新技术的出现,为蛋白质的修饰与合成提供了新思路,对表观遗传学的研究有重要意义。
主要研究内容：
本子课题的研究目的是利用高通量选择的方法，选择出对乙酰基赖氨酸，甲基赖氨酸，荧光氨基酸或具有光交联活性的氨酰-tRNA合成酶，从而在活细胞中表达在特定位点含有这些非天然氨基酸的蛋白质。这些新方法将从以下几个方面回答组蛋白的共价修饰在信号转导中的作用：
（1）修饰后的组蛋白是怎样被识别的？
以前的工作，例如JMJD2A 的 double tudor 结构域 和含有甲基化赖氨酸K4的多肽复合体的结构已经揭示了关于甲基化赖氨酸是怎样被特异性识别的重要机制 (Huang et al 2006)。 但是，固相合成法通常很难合成长度超过40个氨基酸的多肽，成本相当高（40个氨基酸的多肽需要约2000美元），而且因为每一步化学反应都有副产物（每一步氨基酸缩合的产率和准确度通常低于95%），常常很难拿到满足结晶学要求纯度的多肽。因此，利用活细胞自身蛋白质合成和能够识别非天然氨基酸（如甲基赖氨酸和乙酰基赖氨酸）的氨酰-tRNA合成酶的高效率（每一步氨基酸缩合的产率 和准确度通常高于99.9%），就可以以常规蛋白质重组表达的方法大量获得在特定位点有甲基赖氨酸，乙酰基赖氨酸等表达后修饰的全长蛋白质。 配合多肽合成，蛋白质剪切(protein splicing)，天然化学连接 (native chemical ligation) 等化学方法更可以获得有多种修饰的目标蛋白。在这个新方法发展起来以后，就可以大大加速获得蛋白复合体结构的过程，解析含有表达后修饰的组蛋白识别的机理，及其对染色体结构的影响和调控。结合电镜的技术，我们将研究对三甲基化的组蛋白H3K9和HP1蛋白的结合，修饰后的组蛋白的核小体蛋白质和核小体的复合体结构，以及异染色质
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(heterochromatin)的三维结构。
（2）修饰组蛋白有哪些酶？酶活性是否受到调控、是怎样调控的？
经典的生物化学方法是首先准备一个酶的底物和一个检验酶活性的方法，将细胞破碎后，进行多步柱层析，筛选出具有活性的组分，然后用质谱的方法确定酶的氨基酸顺序。例如：通过制备在特定位点有甲基化赖氨酸和组蛋白，和利用去甲基反应会产生甲醛的特点，在多步柱层析后确定JHDM1是消除组蛋白H3在K36位点甲基的酶（Tsukada 2006）。上述的方法虽然是非常强大的，但也存在局限性：第一，酶的底物，譬如在特定位点有修饰的组蛋白可能不容易获得。 第二，酶或者酶的复合体在多步柱层析后可能失去活性或解散，酶催化的反应也可能需要活细胞中的特定条件。应用基因编码的非天然氨基酸作为探针，有可能克服以上难点。例如，在获得对甲基赖氨酸和乙酰基赖氨酸具有特异性的氨酰-tRNA合成酶后，就可以很容易的在任意位点引入甲基赖氨酸或乙酰基赖氨酸。通过在组蛋白底物或修饰组蛋白的酶中引入光交联的氨基酸，就可以直接在活细胞中光交联存在相互作用的蛋白，结合质谱技术，就有可能发现新的组蛋白修饰酶或对组蛋白修饰酶起调控作用的因子。进一步通过生物化学和结构生物学技术，就可以揭示新的机理， 及发现新的药物靶点。
（3）修饰组蛋白的酶在哪些细胞里表达？是怎样被募集到受调控的基因区域的？在何时何种情况下表达？组蛋白的动态特性如何？
要解决这些问题，一个重要的方法是进行荧光标记。对组蛋白进行绿色荧光蛋白标记可能是有困难的，因为在核小体中组蛋白形成紧密的四级结构，而且组蛋白的末端本身具有重要功能。因此，对组蛋白进行基因编码的荧光氨基酸标记，对蛋白本身的干扰降到最低程度，结合荧光漂白恢复的办法，可以研究组蛋白在各种不同情况下的动态特性。由于相当多的修饰组蛋白的酶形成大的蛋白复合体，所以可能用绿色荧光蛋白标记也可能会影响其功能。用基因编码的荧光氨基酸标记，也将有助于回答修饰组蛋白的酶在哪些细胞里表达，在何时何种情况下表达，是怎样被募集到受调控的基因区域的的重要问题。
（4）甲基化和乙酰化是如何影响泛素化的？
组蛋白的泛素化是广泛存在的现象，如酵母的组蛋白H2B在赖氨酸123的泛素化占总H2B的10％左右。RNF 20/40具有针对H2B进行泛素化的泛素连接酶活性，H2B的泛素化可调节H3K4和H3K79的甲基化作用；CUL4-DDB-ROC1复合物则可对H3和H4进行泛素化。事实上在细胞内广泛存在组蛋白的甲基化、乙酰化和泛素化，利用构建的甲基化和乙酰化表达系统，探讨甲基化和乙酰化对组蛋白泛素化的影响。
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