合物结构，这一类蛋白单体的结构报导也很少，测定含有WD40－repeat motif的蛋白单体的结构以及DDB－CUL4－ROC1的复合物结构，能揭示DDB－CUL4－ROC1识别底物组蛋白H3、H4的结构基础，并为研究CUL4－ROC1复合物底物特异性的决定因素奠定基础。而组蛋白H2AX的泛素化参与双链断裂DNA修复信号的传导，双链DNA断裂后首先引起H2AX磷酸化，MDC1与磷酸化的H2AX结合后募集组蛋白泛素化连接酶复合物RNF8－BC13，使H2AX泛素化后结合其他的DNA损伤修复因子如53BP1、BRCA1、Rap80等在断裂位点行使修复功能。因此本课题的一个研究内容就是研究这些组蛋白泛素化连接酶及相关调控蛋白质的复合物结构及其分子组装机制，阐明其在DNA损伤修复过程中的作用机理。在原子分辨率水平上为进一步研究癌症的发生机理和治疗方法打下基础。
（2）在基因转录和mRNA转运过程中起重要作用的组蛋白去泛素化酶及其调控蛋白单体和复合物的结构和机理研究
组蛋白去泛素化酶在基因转录的激活、沉默以及mRNA转运的过程中起着重要的调控作用，例如酵母的组蛋白H2B去泛素化酶UBP10在基因的转录，端粒和核糖体DNA区域的基因沉默，营养物质的转运和细胞凋亡过程中起着重要的调控作用。UBP10能使端粒区的组蛋白H3保持去甲基化状态，并且与端粒的沉默因子sir4结合，使sir4与其他的sir蛋白如sir2、sir3等结合形成沉默因子复合物，保持端粒区基因沉默。然而UBP10的调控作用并不局限于端粒区，在染色体的其他区域UBP10起作用的机理仍然所知甚少。组蛋白H2B泛素化水解酶UBP8通常存在于组蛋白乙酰基转移酶复合物SAGA中，通过sgf11、sus1和SAGA复合物的其余部分结合，UBP8的结合不影响SAGA的乙酰基转移酶活性。在转录起始后UBP8能和磷酸化的RNA聚合酶II的C端结构域结合，水解基因转录区域内的泛素化组蛋白H2B，激活基因转录延伸，调控SAGA依赖的基因转录。UBP8还能通过sgf11以及sus1与mRNA转运途径相关联，影响mRNA的转运，但是组蛋白去泛素化和mRNA转运途径联系的分子机制还不清楚。本课题的另一个研究内容就是解析这些组蛋白去泛素化酶及其调控蛋白质复合物的结构，从结构生物学的角度阐明其在基因转录中的调控机理，以及SAGA复合物中其它组分对UBP8功能的调控机制，揭示表观遗传修饰因子与mRNA转运过程中的相互作用机理。
主要目标
测定组蛋白泛素化连接酶及其底物连接蛋白如含有WD40－repeat motif蛋白的三维结构，阐述泛素化连接酶底物特异性的三维结构基础，揭示组蛋白泛素化连接酶及其调控蛋白在DNA损伤应答途径中的作用机制。
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测定组蛋白去泛素化酶UBP8、UBP10及其调控蛋白如sus1、sgf11的结构，阐明组蛋白去泛素化酶调控基因转录的结构生物学基础，揭示UBP8与乙酰基转移酶复合物SAGA相互作用的机理，以及SAGA复合物中其它组分对UBP8的调控机制，阐明表观遗传修饰因子如组蛋白去乙酰化酶UBP8与mRNA转运途径相互作用的机理。
承担单位
中国科技大学，安徽大学
课题负责人
臧建业
主要学术骨干
张敏
经费比例
课题三、用高精度电镜方法研究组蛋白修饰酶复合体及染色质的高级结构
14%
X射线晶体学、电镜三维重构、NMR和一些光谱学研究是结构生物学中几种重要而且相互补充的手段。本课题将主要利用冷冻电镜三维重构技术研究组蛋白修饰酶复合体和染色质的三维结构，辅以修饰酶的体内功能分析，阐述表观遗传的调控机理。本课题的研究目的是（1）利用冷冻电镜三维重构对大分子及其复合体的结构解析优势，从亚纳米级的尺度上解析一些重要的组蛋白酶－蛋白质复合体的三维结构，以了解这些复合体形成的结构及其对表观遗传的催化机制、底物特异性和酶活性调控机理；（2）利用冷冻电镜技术开展高精度的染色质高级结构研究，以了解组蛋白酶和其它重要蛋白在染色质高级结构的建立和维持中的作用；以及（3）以C.elegans线虫为模型，探索组蛋白的表观遗传修饰在C.elegans个体发育中的调控作用。本课题研究的结果将有助于为本项研究的长期目标，也就是揭示染色质的高级结构及其从11纳米核小体串结构到高级结构的调控机理，打下前期基础。
主要研究内容：
（1）组蛋白酶－蛋白质复合体的结构
很多组蛋白修饰酶在体内都是以复合体的形式存在，而且在很多情况下其酶活性和其它生物功能都与整个复合体的结构有关。尽管Ｘ光晶体学方法在分辨率方面有很大的优势，但
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对于大复合体则有很大的局限性：1）它需要大量的蛋白质，而含多个或高分子量的蛋白质复合体的高产表达是一种挑战；2）结晶成功的可能性与复合体样品的构象、组份和寡聚均一性紧密关联。而冷冻电镜方法不需结晶，所需蛋白量要少得多，而且复合体分子量越大（应用范围通常?500kDa)它的灵敏度越高。
课题一里涉及的几个组蛋白酶复合体，Ｈ3Ｋ4甲基转移酶ＭＬＬ复合体（～1ＭＤa），Ｈ3Ｋ27甲基转移酶ＰＲＣ2复合体（～0.5M Da), ＮuＡ4乙酰化酶复合体（～1.3MDa），和很多其它的组蛋白修饰酶复合体，如ＬＳＤ1，ＳＡＧＡ，ＳＥＴ1，Ｓin3Ａ等都是百万道耳顿以上的复合体。这些大分子及其复合物的大小正好处于cryoEM的合适研究范围，所以对于它们的结构解析，冷冻电镜三维重构有它自己独到的优势。我们将主要利用电镜单颗粒重建（single particle analysis）的方法研究这些大分子及其复合物的三维结构。我们将紧密地与第一课题组合作，将组成复合体的各个单元体（比如组蛋白酶或核小体）或者单元体的一部分的高精度的结构嵌入得到的复合体结构中，从而研究组成复合物的单体（如组蛋白酶，蛋白质）之间的相互作用的结构基础，了解这些单元的相互作用的分子机制及调控机理。同时，我们也将研究突变组蛋白修饰酶－蛋白质复合体和对应的未突变组蛋白修饰酶－蛋白质复合体的结构区别，从而通过对这些组蛋白修饰酶突变体的结构变化了解它的活性调控机理。
（2） 染色质的高级结构；核小体，DNA的组装及其对遗传调控的影响。
核小体是染色质的基本结构。最简单的染色质结构就是一条DNA上的一连串核小体，也就是所谓的11纳米染色质纤维。更高一个层次的染色质结构就是30纳米的染色质纤维，它是由邻近的核小体有序堆积而成的。目前对于染色质高级结构的较为深入的认识也只局限于到30纳米纤维这个层次，而且对于其结构模型、结构的建立和维持机制的理解都还有相当的不确定性。用电镜三维重构的方法研究染色质的高级结构将是本课题的另外一个重要内容。
我们将用冷冻电镜三维重构的方法研究多个核小体组装成的局域二级结构，11纳米染色质纤维以及更高一级的30纳米染色质的高级结构。主要将对染色质二级结构比如核小体重复单元的长度及其调控因素；染色质高级结构建立、维持过程中的各种蛋白质－蛋白质的相互作用，维持机制等进行研究。比如H1组蛋白、组蛋白修饰酶、以及其它一些影响染色质高级结构的蛋白如MeCP2, MENT, Polycomb如何影响染色质的高级结构？它们在染色质高级纤维结构中处于什么位臵？它们在高级结构形成和稳定过程中的作用如何？
冷冻电镜特别适合于超大分子及其复合物的三维结构研究。这也决定了它适合于研究染
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色质的高级结构，比如由核小体，连接DNA和连接组蛋白H1组成的11nm染色质纤维，和由其组装成的30nm染色质纤维的大小正好处于冷冻电镜最适合的蛋白大小区域。目前，对于染色质结构的电镜观察还都局限于对其二维投影的观察，如参考文献2，对其空间结构的理解及模型的建立都有很大的局限性。本课题的着眼点和突破点将是染色质纤维高级结构的三维重建。由于各个染色质纤维的大小形态并不具有同一性，我们将主要利用冷冻电子层析成象（cryo Electron tomography）的方法对单个染色质纤维进行重建，并对其中的重复单元进行亚区平均（Sub-volume averaging）以达到更高精度的三维结构。我们将把组成这些高级结构的单元，如核小体，DNA和组蛋白酶等的原子尺度的结构嵌入到用电镜三维重构的方法得到的这些高级结构的三维密度图中，从而研究单体之间的相互作用的结构基础和调控机制。
（3） 不同活性状态下的染色质三维结构形态的变化及染色质变化动力学
染色质在不同的活性状态下具有不同的功能。我们将用冷冻电镜研究在不同状态下（乙酰化/去乙酰化、甲基化/去甲基化、磷酸化/去磷酸化、泛素化/去泛素化）染色质的三维形态以了解不同活性状态对染色质的高级结构的影响及调控机制。
同时，染色质形态在所有结构层次上都是在动态变化的，这也决定了染色质的重要功能。我们将在动态变化中的染色质的不同形态用快速冷冻的办法固定下来，然后对不同时间段的染色质形态进行冷冻电镜三维重构，通过对动态变化过程进行“snapshot”摄影的方法对染色质变化的动力学及其调控因素进行研究。
电子显微镜，特别是冷冻电镜的样品可以是活性状态下处于自然缓冲液中的染色质。它提供了一个在正常生理环境下研究染色质形态变化及其动力学的良好工具。
（4） 体内环境下的表观遗传修饰功能研究
获得了组蛋白修饰酶及其复合物的三维结构信息后，我们将在生物体内进行相应的功能研究。在这部分研究工作中，我们主要利用模式生物C.elegans的研究平台探索组蛋白的表观遗传修饰在个体发育，尤其是C.elegans寿命，性腺发育和生殖发育中的调控作用。我们知道C.elegans线虫具有清楚的基因组遗传背景，并具有强大的RNAi和突变体库，遗传操作方便，是遗传学和发育生物学研究的良好模式；并且一些组蛋白修饰酶在C.elegans中已发现相应的同源蛋白，如人类H3K4的去甲基化酶RBP2在C.elegans中的同源蛋白RBR-2的RNAi处理可以增强H3K4的甲基化修饰，造成生殖器官发育的异常。通过体内功能的研究，我们预期的研究结果不仅有助于揭示组蛋白修饰酶的生物体功能，而且也将弥补表观遗传在线虫研究中的不足。
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主要目标
本课题的预期目标是用冷冻电镜单颗粒三维重构的方法解析出几个重要的组蛋白
酶与蛋白质复合体的三维结构，研究组成这些复合物的单体（如组蛋白酶，蛋白质）之间的相互作用的结构基础，从而了解这些单元的相互作用的分子机制及其对表观遗传的催化机制、底物特异性和酶活性的调控机理。用冷冻电子层析成象结合亚区平均的方法解析出核小体之间组装成的局域二级结构以及不同活性状态下的染色质纤维的三维结构，以研究染色质的组装调控机理以及组蛋白酶和其它重要蛋白在染色质高级结构的建立和维持中的作用。同时，辅以组蛋白修饰酶在C. elegans线虫的体内功能分析，探索组蛋白的表观遗传修饰在C. elegans个体发育中的调控作用。
本课题预计在每个方向上作出1－2个有代表性的工作，并发表于国际知名学术杂志上。同时，我们也将通过这一项目的启动，推动冷冻电镜三维重构技术在我国结构生物学领域的发展，培训一批重要的青年骨干人才并发展相应的技术。
承担单位
中国科学院生物物理研究所
课题负责人
朱平
主要学术骨干
赵艳梅
经费比例
课题四、表观遗传调控过程中重要蛋白的结构与功能研究
表观遗传调控是多层次的。最直接的调控就是组蛋白上的共价修饰，其次就是组蛋白修饰酶活性调控和其在体内的定位。本课题瞄准在表观遗传调控过程中参与调节功能的重要蛋白（或结构域）及其复合物作为研究对象，综合运用信息生物学、分子生物学、生物化学、蛋白质化学、细胞生物学和结构生物学的理论和方法，研究一些重要蛋白（或结构域）在参与调控组蛋白修饰过程中的分子机理和作用机制。通过解析这些蛋白和蛋白复合体的精细三维结构，来探讨结构和功能的关系，从而阐明蛋白之间的分子作用机制及的相互作用机理，
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