为获得稳定的、均一组分的蛋白质复合物，我们将尝试不同的原核和真核表达系统和载体（包括共表达）、不同的分离和纯化方法，并通过酵母双杂交、体外Pull-down和共沉淀加以验证，以获得具有活性、且适合于结构和功能研究的稳定蛋白质复合物。另外，我们将运用生物信息学方法构建蛋白-蛋白相互作用的模型，并根据相互作用方式对蛋白质表面上一些氨基酸进行突变和修饰，以增加蛋白-蛋白之间的相互作用能力，有利于蛋白质复合物的形成。此外，运用最新发表的以相图为基础的生物大分子“可结晶性”的新概念提高蛋白质晶体生长的成功率。
为保证实验的成功，我们将同时开展对一些具有重要功能的蛋白质结构域的克隆、表达和纯化的工作，由于目前对这些含有多结构域的大真核蛋白质的结构域的划定尚不明确，我们将运用生物信息学的方法来帮助进行蛋白质的结构域预测，并通过系统的片段缺失和点突变筛选，寻找具有合适大小和功能的蛋白质结构域进行研究。
（2）稳定蛋白质及蛋白质复合物的晶体生长和结构解析
一旦获得可供结构研究的蛋白质和稳定蛋白质复合物样品，我们将运用动态光散射仪对蛋白样品的溶液状态进行分析，考察其是否处于均一状态，在不同条件（温度、浓度、pH等）下的稳定形态和凝聚状态，同时运用溶液光谱（包括CD光谱和荧光光谱）方法分析蛋白质在溶液中的构象变化。综合各种因素，初步确定适合于结晶实验的条件。然后，进一步摸索晶体生长的条件，尝试大量不同的沉淀剂、蛋白质浓度、pH和缓冲体系、以及不同添加剂等，得到高衍射质量的晶体用于X-射线衍射分析。一旦获得蛋白晶体，将利用X-射线衍射仪进行初步衍射实验，以帮助进行结晶条件的优化和低温冷冻条件的筛选。具有高衍射能力的蛋白晶体将运用国内外同步辐射光源进行高分辨率的X-射线衍射数据的收集。并运用单波长反常散射法、多波长反常散射法、同晶臵换法、和分子臵换法解析各种蛋白和蛋白复合物的三维晶体结构。
(3) 蛋白动态复合物相互作用介面的结构与动力学研究
溶液NMR技术是研究蛋白质-蛋白质相互作用、测定蛋白质-蛋白质复合物三维结构的很有用的工具。根据蛋白质-蛋白质相互作用的强度，可选择相应的NMR技术来研究蛋白质-蛋白质的相互作用，如化学位移扰动法、分子间转移NOE(TRNOE)、酰胺质子交换率扰动法、横向或纵向弛豫速率扰动法、线宽变化、分子间饱和转移、分子间NOE等，以及各种各样的滤波或半滤波技术（ filter or half-filter）。
细胞内许多蛋白质之间存在着很弱的相互作用（解离常数Kd > 10-6 M），只能形成低亲和力的、瞬时复合物，但这些瞬时复合物在细胞活动的分子调控中发挥着相当重要的作用。
5
我们将选择分子量合适的蛋白质-蛋白质复合物，运用异核多维NMR技术，在接近生理条件的溶液状态下，研究这些蛋白质-蛋白质复合物，特别是低亲和力的、瞬时蛋白质复合物的动态结构和性质、蛋白质-蛋白质相互作用的分子机制，探测蛋白质-蛋白质是否发生相互作用及其亲和力（Kd）、蛋白质-蛋白质的结合界面等。通过测定分子间的NOE确定蛋白质分子之间的距离约束，在稀释的定向介质中,如磷脂双层混合胶粒（Bicelle bicelle）, 聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）, 纤维状病毒（Filamentous viruses）等, 测定残留的偶极耦合常数(residual dipolar couplings)以确定蛋白质分子之间的相对取向，从而获得蛋白质-蛋白质复合物的空间结构。
蛋白质-蛋白质的相互作用往往会引起蛋白质动力学的改变。NMR技术被广泛地用来揭示蛋白质分子和蛋白质-蛋白质复合物的动力学特征。我们将利用异核多维NMR弛豫测量实验，研究皮秒-纳秒时间尺度的蛋白质分子结构的柔性与运动性，以及微秒-毫秒时间尺度的构象交换。通过改变实验条件（如实验温度、蛋白质浓度、pH值、配基类型等），研究蛋白质-蛋白质相互作用过程的热力学、动力学和分子作用机理。
（4）大复合体的冷冻电镜研究
冷冻电镜方法结合三维重构是近年来发展迅速并正在取得重要突破的技术。和其它方法相比，它具有以下几个方面的优势：1.保持生物样品的活性和功能状态；2.无须制备晶体，特别适合难于结晶的大分子及其复合物的三维结构判定；3.可以做到制样，数据收集，三维重构全过程自动化，为高通量的大分子及其复合物的快速三维结构解析打下基础。同时，随着设备的改进和技术的提高，电镜三维重构的分辨率也迅速提高。现在最高精度已经达到约4A左右。我们将用冷冻电镜方法来研究蛋白质复合体里各亚基之间的空间关系、蛋白质复合体与核小体的相互作用、染色质的高级结构和不同活性状态下的染色质三维结构形态的变化及染色质变化动力学。
（5）组蛋白修饰酶活性测定和蛋白质复合物的功能分析
我们将利用成熟的甲基化／去甲基化酶、乙酰／去乙酰化酶、泛素化连接酶/去泛素化酶、激酶等酶活性测定方法来鉴定和比较野生型和突变型的酶活性差别、以及单体和复合体中的酶活性差异。以下方法将用来测定蛋白质-蛋白质相互作用和寻找与已知功能蛋白质相互作用的蛋白和蛋白复合物： 表面等离子共振（SPR)；酵母双杂交（two-hybrid）系统、体外Pull-down和免疫共沉淀（Co-IP）、二维电泳、TAP和质谱等功能蛋白质组学的方法。
我们将通过对蛋白和蛋白复合物的晶体结构的分析，找出在蛋白的生物功能和蛋白-蛋白相互作用中发挥重要作用的氨基酸，运用生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学和
6
其它生物学和生物物理学方法加以验证；阐述蛋白生物功能的分子基础和作用机理；在细胞水平上验证我们的假设和理论，并且构建相应的基因缺失或基因转染的模式生物，筛选不同表型，建立重要蛋白的功能与疾病的发生和发展的关系。
（6） 体内合成有活性的含共价修饰的组蛋白的化学生物学方法
具体的做法是修改大肠杆菌或其它细胞内的遗传密码，使得无义的“UAG”密码对
应于感兴趣的非天然氨基酸。筛选对非天然氨基酸具有特异性的氨酰-tRNA合成酶的技术路线如下：首先在目标细胞中引入一个外源的氨酰-tRNA合成酶 和tRNACUA, 在目标细胞中外源的氨酰-tRNA合成酶和tRNACUA保持活性，但不与内源的氨酰-tRNA合成酶和tRNA反应，这个条件称为生物正交性。之后还要改变氨酰-tRNA合成酶的专一性,使其只催化tRNACUA与非天然氨基酸发生氨酰化反应。采取的方法:一是将 氨酰-tRNA合成酶 活性部位5-6个氨基酸残基进行PCR随机突变建立氨酰-tRNA合成酶突变库。然后对氨酰-tRNA合成酶突变库使用正负双向选择法：正选择得到对天然氨基酸或非天然氨基酸有活性的氨酰-tRNA合成酶，主要是通过构建一个含有UAG密码子的氯霉素乙酰转移酶，如果无氨酰-tRNA合成酶活性，则细胞无法表达全长的氯霉素乙酰转移酶而无法存活。负选择剔除掉对天然氨基酸有活性的氨酰-tRNA合成酶，识别内源的天然氨基酸的质粒编码一种细胞内毒素而死亡。 最终得到只对非天然氨基酸有专一性的氨酰-tRNA合成酶。凝胶电泳和质谱实验验证最终将非天然氨基酸通过特殊密码子UAG添加到蛋白质链中。
（7）基于表观遗传调控的药物开发前期工作
我们将用四种途径初步筛选出一系列的候选小分子：1）基于蛋白质结构的计算机虚拟筛选；2）基于化学小分子文库的高通量药物筛选；3）基于靶蛋白结构，合理设计针对性强的、结构新颖的小分子抑制剂；4）对于已知的小分子抑制剂做结构和性能改良。以下是以去乙酰化酶HDAC8为例的几种筛选途径的典型步骤：
a）基于靶蛋白HDAC8的结构模型，通过对已知活性部位和结构表面的分析，得到几个潜在的小分子结合位点；
b）选定一个规模合适的小分子结构库，将库中的每个小分子和几个潜在的结合位点进行快速的对接，初步筛选出一系列的候选小分子；
c）对这一系列的候选小分子，进行较精细的分子对接，将候选小分子规模缩小到实验容许的水平；
d) 然后检验候选小分子是否有生物学活性（具体见课题六研究内容）；
7
基于化学小分子文库的药物筛选
我们将使用具有一定规模的化合物文库进行高通量的HDAC抑制剂筛选。中山大学正在建设一个约有6万个小分子化合物的文库可供使用。中科院药物研究所也具有一个规模可观的小分子化合物的文库。中科院广州生物医药与健康研究院的丁克教授愿意提供一个小规模的小分子化合物的文库（约6000个化合物）。对候选小分子化合物的生物学活性再进行系统检测 （具体见课题六研究内容）；
基于靶蛋白结构，合理设计、合成针对HDAC8的结构新颖的小分子抑制剂 a）对筛选得到的先导化合物，通过分子叠合等方法构建出小分子的三维药效团； b）通过计算模拟的方法揭示小分子结合部位和三维药效团之间相互作用的分子机制； c）根据靶蛋白结合部位和三维药效团之间的作用模型设计出更合理有效的小分子抑制剂。
d) 根据上述设计，利用组合化学方法合成化合物；
e) 对所合成的小分子化合物的生物学活性再进行系统检测（具体见课题六研究内容）； 通过对SAHA等HDAC潜在广谱类抑制剂进行结构改造，得到起专一性抑制作用的小分子
a）建立SAHA或其他的HDAC广谱类抑制剂和HDAC8的相互作用的可能的分子模型； b）从分子模型出发，修改广谱类抑制剂的药效基团，通过自由能计算等方式提高小分子的结合专一性；
c）对设计的结果通过对组蛋白乙酰化测定观察这些化合物对HDAC的抑制效应，迭代这一过程，逐步保留对HDAC8特异性升高，对其他组蛋白去乙酰化酶特异性减弱的操作。
3、 项目创新点
本项目的主要创新点在于瞄准表观遗传学的分子机理这个重大前沿科学问题进行系统性、系列性、多层次、多方面的研究。本项研究对象包括了所有常见的组蛋白修饰酶；研究对象的复杂性包括了从单个蛋白质或其中的结构域到多蛋白复合体以及蛋白质复合体与核小体的结合；研究的手段包括X光晶体学、核磁共振、冷冻电镜等主流结构生物学研究手段，以及生物化学、化学生物学、细胞生物学、遗传学、药学等方法。研究目标从搞清楚组蛋白的赖氨酸上加一个还是三个甲基到组蛋白修饰对于ＤＮＡ损伤应答和mRNA转运调控的影响以及抗癌药物的开发。我们相信，这样的课题选择和科研力量的凝聚是开展原始创新的基础研究的一大特色，也是促进有自主产权的药物开发的动力。
8
4、取得重大突破的可行性分析
我们对于本项研究取得突破性进展充满信心，原因是：1）本项目有一支在表观遗传结构机理研究有深厚基础的充满活力的年青研究队伍。这支队伍已在组蛋白甲基化酶、去甲基化酶、去乙酰化酶的结构里已取得了国际领先的成绩。本支队伍的成员也在化学生物学里开拓了一个应用广泛的原创性领域、在利用冷冻电镜进行高精度结构解析方面作出的举世瞩目的贡献、在蛋白质-蛋白质相互作用和在肿瘤的靶向治疗和药理研究的一系列先进工作。这些成绩和研究经验是本项目成功的基础。2）本项目的课题选择瞄准了表观遗传学这个重大科学问题的前沿。同时，这些课题也是切实可行的。每个课题组都已在相关的领域有深厚的积累和基础。有相当多的蛋白已经表达成功，而且个别蛋白质晶体已经得到。3）本项目的几个课题组具有互补的技术优势。这对于合作研究和攻关一些技术难度高、科学意义重大的课题，例如高分辨率的染色质高级结构，将有不可取代的优势。 5、课题设臵
本项目的主题内容是综合结构生物学手段、其它生物物理和生物化学方法来揭示表观遗传学的一些重要机理。本项目的六个课题利用X光晶体学、核磁共振、冷冻电镜等主流结构生物学研究手段，以及生物化学、化学生物学、细胞生物学、遗传学、药学等方法从多方面、多层次来探寻表观遗传学的分子机理。具体的课题设臵见下：
课题一、几种主要组蛋白修饰(甲基化/去甲基化,乙酰化/去乙酰化)的催化机制和调控的结构机理研究
组蛋白修饰酶的结构和功能研究是表观遗传学的重要组成部分，也是国际上近年来的研究热点之一。本课题的研究目的是从原子分辨率的尺度上来揭示在表观遗传中至关重要的几类常见组蛋白修饰酶(包括甲基转移酶、去甲基化酶、乙酰转移酶和去乙酰化酶)的催化机制、底物特异性和酶活性调控机理。本课题研究的结果将有助于提高对于表观遗传这一重要生命现象的理解，为以干预表观遗传系统为目标的药物研发提供结构信息。这项研究也将为我们的长期目标，也就是揭示染色质的高级结构及其从11纳米核小体串结构到高级结构的调控机理，打下坚实的基础。
主要研究内容：
一、组蛋白甲基化的结构基础
9