简介
PRIMER PREMIER 是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件 利用它的高 级引物搜索 引物数据库 巢式引物设计 引物编辑和分析等功能 可以设计出有高效扩增能
也可以设计出用于扩增长达 以上的PCR产物的引物序列 力的理想引物50kb 该软件主要由一下四个主要功能板块组成 GeneTank 序列编辑 Primer 引物设计
Align 序列比较 酶切分析 Enzyme Motif 基序分析
新版更新
种间交叉引物设计 利用来自多个物种的序列设计扩增引物 病理检测引物设计 可用来在高保守区域设计引物 等位基因特效引物 设计专用于扩增某一类相关序列中特定成员的引物
基础指南
这段指南并非详细的说明 仅为使用者对PRIMER PREMIER的菜单选项有一个直观的了 解 四个功能板块都有各自的窗口和菜单 正在使用中的窗口就是您所见到的窗口 以下列出 了各功能板块的主要菜单选项
GeneTank File, Edit, View, Search, Function, Translate, Window,Help.
Primer File, Edit, Function, Report, Graph, Window, Help. Enzyme File, Function, Window, Help. Motif File, Function, Window, Help. 使用功能菜单时 该菜单所属的窗口就会被激活 利用各菜单中的window选项记录的所 有打开的窗口 可以方便的在各个窗口之间进行切换
所有的列表都有复选功能 对于CTRL 系统而言 在点击同时按住 windows或Power Mac 键即可将当前的选择加入选单 按住 SHIFT键同时点击 可以选择两次点击之间范围内的所有 选项
6
GeneTank
利用GeneTank您可以打开DNA或者蛋白质序列 也可以选择不同的阅读框架 共三种
将DNA翻译成蛋白质或利用蛋白序列反推出DNA序列 为方便使用 软件已经提供了普通密
码子列表和几种线粒体密码子列表 您也可以输入您自己的其他线粒体密码子列表 序列编辑
器提供了包括多媒体语言校读在内的完整的序列编辑功能
这一功能板块包括以下部分
GeneTank 打开 编辑及翻译序列 浏览
Translation 将打开的序列翻译或反推成其他序列
Edit Codon Table 编辑翻译所依据的密码子列表
GeneTank窗口
GeneTank的窗口用来显示序列及其文件题头信息 序列可以 3碱基10碱基一组显示 您 可以将打开的序列翻译或反推成其他序列 您也可以使用通常的拷贝 剪切和粘贴命令编辑当 前序列 GeneTank的窗口上也有启用Primer Align Enzyme Motif 功能板块的快捷键
查看序列
点击相应按钮或从View菜单中选择 您可以查看文件题头 改变5 末端序列起始位置
选择3碱基或10碱基一组的显示方式 文件题头是指存在于序列文件中 位于序列信息上游的
文字内容 点击 改变 5 末端序列起 header按钮或从View菜单中选择可以显示文件题头信息
始位置 默认为1 序列将从您指定的5 位置开始显示序列
可选操作
View >Show Header
View >Grouping
View > 5’ Seq No 某些版本没有这一项
打开已有序列
使用菜单File >Open 可以激活文件选择对话框 文件
用来打开您希望处理的包含特定序列的
Windows用户请注意 默认设置的DNA序列文件后缀为SEQ 您可以使用其它的任何序列文件类型 蛋白序列文件后缀为PRO 当然
如果序列文件是GenBank的标准格式PRIMER PREMIER会自动识别打开文件中的序列起 始位置 或是您曾经使用本软件菜单中File > Save命令以PRIMER PREMIER默认格式保存过
该文件 序列将自动打开 如果打开其他格式的序列文件 将出现一个可卷动的Import Sequence
窗口并显示全部序列 在序列第一行的起始处双击 则双击处以前的所有信息将被认为是文件 题头 然后PRIMER PREMIER会自动剔除非序列字符并将序列在GeneTank里打开
使用提醒 如果您选错文件 重来一次即可
发现并没有您所希望的序列
只需要关闭Import Sequence 窗口
创建新序列
该项功能可以让您手动键入一个新的序列 您可以键入任何DNA或蛋白序列并存在您指定
的文件夹内 并可以象其他如GenBank格式的文件一样进行操作
7
保存序列
使用本软件保存的序列 可以被软件自动识别而无需让您指出序列起始位置 建议您在诸 如以下情况保存序列
您需要经常使用同样的序列
您已经编辑完一段序列并希望保存结果 您已经输入一段新序列
编辑序列
只需在GeneTank窗口内您就可以方便的编辑DNA或蛋白质序列 而编辑翻译或原始序列 十分方便 在任一序列上的改变将会正确的反应到与之相关的其他序列 例如如果你在一 段蛋白序列上DNA的原始序列 删除一个氨基酸残基 无论该序列是被翻译的或是用来反推
在相应DNA上的对应三位密码子将同时被删除 但如果您改变一段翻译出的序列 这一改变将 仅仅在另一段由此翻译出的序列而不会出现在原始序列上 编辑序列可以使用直接键入或利用 剪贴板
通常的剪切 拷贝 其快捷键分别是CTRL-X, CTRL-C和 粘贴同样可以方便的在此使用 CTRL-V
软件提供三碱基一组的显示方式
在键入DNA序列时可以使用A C G T或者附录B所列出的多义碱基 时可以使用附录C中所列出的氨基酸单字母记号
以利于蛋白相关的工作
在键入蛋白序列
当您完成编
可以从任何文本编辑器如记事本中的剪贴板中拷贝一段序列并将其粘贴进来
辑后请注意保存序列
查找
利用GeneTank窗口上的 Find 按钮 您可以从指针起始位置开始查找序列中一段特定
字符 查找到第一个后 您也可以使用 Find Next 使用Search 按钮在余下的序列中继续查找
菜单 选择Go To Position可以将指针移到您指定的位点
可选操作 某些版本在Edit菜单下
Search >Find
Search >Find Next
Search >Go To Position
查看不同链
要查看该序列的互补链 您只需要点击GeneTank窗口上的A按钮 就会显示该序列的互
此时互补 而点击S按钮 就能恢复成原来的序列 您亦可点击dsDNA按钮以双链形
补链 式显示
可选操作
View > Sense Strand
View > Anti-sense Strand View > ds DNA
语音校读
在GeneTank打开一段序列后 您可以按下语言按钮启用语音校读功能 序列将从指针所
在的位置开始被依次朗读序列 再次按下语音按钮将停止朗读 按下键入朗读键将在键入的同
8
时朗读输入的序列 再次按下该按钮可以停止键入朗读
可选操作
Function > Speaker
编辑序列比较结果
当一项多序列比较完成后 比较结果可以通过编辑来获得更准确的配对 通常ClustalW法 则能够给出一个准确的比较结果 但对于个别情况或出于特殊要求 因而手工编辑并非必要 可能有这种需要 所以本软件也提供这一功能 将点击指针指向的碱基可以实施改动 按下空 格键可以插入一个空隙 按下 一旦比较结果被改动 最大和最 Delete键则可以删除一个空隙 小同源性参数也会自动改变
粘贴序列窗口
这一窗口使得一段核酸序列通过选择以四种不同的方式粘贴上去
分别为正向 As is 以及反向互补 reversed reverse 反向 互补 complemented
complemented 这样便于从其他程序中粘贴序列而无需考虑其序列保存的方向
参数设置
Preferences 参数设置 窗口可以改变本软件所使用的多种默认参数
看及更改引物评分参数 设定二级结构在引物评分中所占的权重系数
也可以允许您查
默认引物长度 默认值为25
默认引物长度在Primer Premier窗口使用即点即选功能时得到的引物长度
Primer Premier窗口启动时的初始默认值这项数值可以设定为1到70个碱基
该项参数也是
引物对搜索最大值 默认值为100
在自动搜索引物时 由于该软件按照引物评分来衡量引物效率 得到的结果数量可以很多
有些引物虽然合乎标准但评分较低 可能没有全部列出的必要 尽管我们设置了100对引物这 一较大的数值 您仍然可以改变该项参数为10到1000之间的任意值 核酸浓度 默认值为250 pM
根据文献 这是没有自身配对时退火的寡聚核苷酸的总浓 7 Freier等 提供的计算公式
度 它即不是引物浓度也不是起始模板浓度 而是PCR过程模板的 产物的浓度 由于在PCR
浓度变化很大 很难确定具体数值 根据文献11的建议 Rychlik等 一般经验公式在普通PCR 反应中将其当作 250 pM 这项数值被用来计算引物的退火温度
9
单价离子浓度 默认值为50 mM 这项数值是指反应混合液中所有单价离子的总浓度 游离Mg2+离子浓度 默认值为1.5 mM
这项数值是指反应混合液中充当辅基的Mg2+离子浓度
总Na+当量
这项数值是根据单价离子浓度和游离Mg2+离子浓度计算得来 计算公式如下 方根
总Na+当量 单价离子浓度 4 Sqrt Mg 2+离子浓度 1000 游离 这项数值用来计算引物的退火温度
Sprt 即取平
自由能计算设置温度 默认值为25????
这项数值用来计算自由能 G 自由能计算公式为 评分参数
G= H T
S.
Rating parameters 评分参数 窗口是用来设定二级结构在引物评分中的权重系数 二
级结构越稳定 引物评分就会越低 相对于在引物中间形成的二级结构来说 3 末端的二级 结构对PCR扩增的影响会更大 为了将这一效应计算在内 软件将3 末端的二级结构的自由
能数值 G减去3 末端的二级结构显得更加稳定 1 这一修正会使
这一修正值是根据未公开实验结果制定的 您可以根据自己的需要来更改
软件只标注是引物二级结构中最稳定的一个自由能数值 如果没有检测到二级结构 G 则该数值为0
序列比较
这一部分仅在Primer Premier的Windows版本中使用 对于Macintosh系统 序列比较是
提交到网上完成并下载比较结果 在Primer的教程中有关于这方面的完整信息
Align 序列比较 窗口让您将已经打开的序列进行比较 序列选择框显示所有将要比较
的序列 使用 Add 和 Delete 按钮可以增加一个序列或移除一个序列
序列比较参数设置
您可以利用Alignment Parameters 序列比较参数设置 窗口来修正ClustalW法则用来优
化比较结果的各项参数 序列比较可以用两种模式完成 一种准确但较慢 slow/accurate
一种快速但较粗略 fast/approximate 选择不同的模式将会得到不同的结果 SLOW/ACCURATE模式的序列比较参数
这些参数无法改变序列比较的运行速度 它们被用来对序列比较评分然后换算为百分比数
即最后显示的百分数 并转化为进化树上的进化距离 值
1 Gap Open Penalty 比较结果中一个空隙的罚分
2 Gap extension penalty 比较结果中一个空隙每延长一碱基的罚分 3 Protein weight matrix 这是描述氨基酸之间的相似性的评分标准 4 DNA weight matrix 为核酸配对制定的评分标准 包括IUB多义密码子
使用 Options 按钮可以打开序列比较的参数设置窗口
10