附录 A 公式法则
融 链 温 度 的 计 算 基 于 相 邻 二 碱 基 对 热 力 学 理 论 nearest neighbor thermodynamic theory 计算公式出自与Freier 等发表的文章 文献 7 这些是高度精确的相邻二碱基对Tm 计 算法则 为得到尽可能准确的计算结果 对公式进行了部分修正
引物融链温度Tm计算公式
Tm = H/ S + R ln C/4 H 是螺旋结构的焓值 S 是螺旋结构的熵值 C 是DNA浓度 [K+] 是盐浓度
+ 16.6 log [K+]/ 1 + 0.7 [K+] - 273.15
每一条寡聚核苷酸的 H 和 文献2 计算 由于 S 根据 Breslauer K.J.提出的理论
Breslauer K.J.使用的热力学计算方法是在1M的Na+条件下 所以有必要加入一个参数[K +]来 根据盐浓度修正公式 [K+]的计算要同时考虑反应体系中的单价离子和游离Mg2+ [K+]数值由 以下公式计算 Sprt即取平方根
[K+] 单价离子浓度 4 Sqrt 游离 Mg2+离子浓度 1000
盐浓度即[K+] 在参数设定 preferences 中也称为Na+ 当量 会根据单价离子和游离Mg2+
浓度而自动更新 默认单价离子和游离Mg2+T浓度分别为50.0 mM 和 1.5 mM 这样总盐浓度 等于204.9 mM 在文献7 Freier et al. 提供的计算公式中 C值是没有自身配对时退火的寡聚核苷酸的
总浓度 它即不是引物浓度也不是起始模板浓度 而是PCR过程模 产物的浓度 由于在PCR 板的浓度变化很大 很难确定C的具体数值 根据文献 et al. 一般经 11的建议 Rychlik, W. 验公式在普通PCR反应和测序反应中将其当作 您可以打开 250 pM 通过File 菜单下的选项 Preferences窗口来修改这项预设值 产物融链温度Tm的计算公式
由于相邻二碱基对 nearest neighbor 模型只适用于例如引物的寡聚核苷酸 PCR产物
的融链温度不能使用该模型提供的公式来计算 计算较长的双链DNA 可以使用Wetmur J.G. 文献12 的公式
产物Tm=81.5 + 16.6 log
[K+]/ 1+0.7[K+]
盐浓度即[K+] 在参数设定 preferences
物的GC% 和长度也要考虑在内
最适宜退火温度计算公式Ta Opt
PRIMER PREMIER 使用Rychlik的公式 文献11 自动预测引物对的优化退火温度
PCR反应的退火步骤使用该优化退火温度 能提高目的产物产量并减少错误的产物
中也称为Na+ 当量
+ 0.41 %G + %C
也是由上述公式得来
- 500/length
产
Ta Opt = 0.3
引物Tm
+ 0.7
– 25
在公式里的引物Tm是相对不稳定的引物
链温度 计算方法参看上述相关章节
产物Tm
在
产物对的融链温度
产物Tm则是PCR产物的融
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自由能 G 计算公式
焓值和熵值的计算是基于Breslauer等 文献11 其中包含共 建立的热力学参数集 10种
Watson-Crick DNA的相邻二碱基对作用 nearest-neighbor interactions 模式 根据这种方
法一段寡聚核苷酸的自由能可由其中每一双核苷酸的焓值和熵值以及预设参数中指定的温度计 算出来 该预设温度可以在Preferences窗口根据实际的环境温度进行修改 该实验特指在1M
NaCl浓度下的PCR反应
G= H– T H 为焓值 T 为温度 S 为熵值
S
3 末端和内部的配对都能形成二级结构 而3 末端封闭的二级结构对扩增效率的影响更
G值将减去大 考虑到这一点 1 3 末端的二级结构自由能
单个引物评分 Rating 公式
Rating = 100 - G Dimer 1.7 + G Hairpin 1.4 + G False Priming 1.5
错配 二聚体 评分 100 - 发卡 G 1.4 + G 1.5 G 1.7 +
当引物搜索完成后 一般很难判断可供选择的引物中到底哪些引物会有较好的扩增效果
PRIMER PREMIER 将根据引物二级结构的稳定性自动给引物评分并按评分排序 如果引物
二级结构较稳定 其评分就较低 反之 二级结构较不稳定 评分就较高 评分是根据引物形 成二级结构稳定性的热力学数据来计算 这些数据在评分中占的权重系数是根据经验确定的 这些系数可以在Preferences窗口修改
引物对评分 Rating 公式
Rating = Average of sense and anti-sense primer rating - Tm difference between
primers 1.7 1.3 - G Cross Dimer
评分 正反引物平均评分 G 1.3 Tm – 交叉二聚体 差异 1.7
Tm差异和交叉二聚体自由能 G引物对评分是根据正反引物的平均评分 计算的
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附录 B 多义碱基表
以下是软件可以识别的DNA中多义碱基的代码及含义
代码 含义 B 除了A D 除了C H 除了G I 次黄嘌呤 K G或T/U M A或C N
A C G T/U R A 或G S C或G V 除了T/U W A或T Y C或T/U33
附录 C 氨基酸缩写代码
单字母记号 A C D E 以下是氨基酸的单字母记号和三字母记号
三字母记号 Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr
英文名称 Alanine Cysteine Aspartic acid Glutamic acid Phenylanaline Glycine Histidine Isoleucine Lycine Leucine Methionine Asparagine Proline Glutamine Arginine Serine Threonine Valine Tryptophan Tyrosine
中文名称 丙氨酸 半胱氨酸 天冬氨酸 谷氨酸 苯丙氨酸 甘氨酸 组氨酸 异亮氨酸 赖氨酸 亮氨酸 甲硫氨酸 天冬酰胺 脯氨酸 谷氨酰胺 精氨酸 丝氨酸 苏氨酸 缬氨酸 色氨酸 酪氨酸
F G H I K L M N P Q R S T V W Y
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附录 D 软件上限
引物长度
序列长度 最大限制性内切酶识别位点长度 最大切点显示数量 最大引物对搜索数量 70nt 50 kb 19 50 1000
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