Edit Primer 引物编辑 窗口
引物编辑 Edit Primer 窗口可以用来设计用于定点突变的引物或分析一条已有引物序列 Power Mac 在windows系统或的Command-X Command-C 及Command-V系统中 您可以
拷贝和粘贴 删除当前引物序列使用CTRL-X CTRL-C和CTRL-V快捷键来实施剪切 并从
Paste 粘贴 剪贴板上粘贴是分析一条已有引物的好方法 进行粘贴时窗口会激活 用以
将引物序列转化为反向 互补或反向互补形式 您也可以手工键入引物序列 一旦引物被编辑
按钮即可分析编辑后的引物 发生变化 Analyze 按钮就可以使用 点击 Analyze
您可以修改实际序列或是翻译后的氨基酸残基 如果您修改氨基酸残基 相应位置可能出现多
义密码子
除了上述的引物性状和二级结构资料 具体参阅PRIMER PREMIER窗口的章节 该窗
口也提供了限制性酶分析功能 您可以通过点击 Enzyme 按钮 通过手动或软件提供的筛 选方案来选择一组限制性酶
您可以使用 Prime 按钮来将引物移动到更合适的结合位点 通常这项功能可以让您确 认是否有其它比当前位点更稳定更适合的结合位点存在
其他信息 如果您希望改变阅读框或使用其它密码子列表 请关闭本窗口 从主菜单上选 择Function >GeneTank激活GeneTank窗口 再选择 打开 Translate > Change ParametersSelect Codon Table窗口来改变阅读框或选择其它密码子列表然后重新打开本窗口
可选操作
Function > Edit Primer Search Criteria 搜索标准 窗口
以下是基本搜索标准的详细信息
根据PCR引物 测序引物或杂交探针的不同要求 选择不同的搜索标准是很有必要的
PRIMER PREMIER 会根据您的选择来调整自动搜索的标准 某些用以优化引物扩增能力的
标准不一定也适合测序引物或杂交探针的设计 这两者需要的是较高的退火温度 因此当您选 择不同的搜索标准 PRIMER PREMIER将对相关标准作出调整以适应不同的要求 搜索公式 中使用的具体参数请参看后面的Automatic Search Parameter 自动搜索参数 章节 Search Type 搜索类型框
当前引物找寻合适的反向引物
默认设置下 Search Range 搜索范围 是当前序列的全长 默认PCR产物长度为100 bp
到500 bp 如果您是搜索单个引物 该数值将不会起作用 您也可以为搜索设定Primer Length 引物长度 您将会在下一章节了解该项设定的具体作用
将指定您要搜索的是单个引物
两条单独引物 引物对或为
最后您可以设定Search Mode 搜索模式 为自动或手动 除非您有很特殊的要求或想完
全控制特定的搜索参数 建议您使用自动搜索 利用PRIMER PREMIER找到多条引物 再从
中通过详细分析来挑选合适的使用
可选操作
Function > Search
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Search Parameter Windows 搜索参数窗口
搜索可以使用其它的自动搜索方法或者手动搜索
当您希望搜索的引物不会与其它存在与反应中序列发生错配 您可以在激活False Priming
按钮选择这些序列文件 选项后 利用 Files
Automatic Search 自动搜索
尽管PRIMER PREMIER已经自动设置了一些数值 您还是可以选择在自动搜索中需要使
用哪些参数 点击去掉相应参数左边框中的 则该参数在搜索中不会被考虑
自动搜索开始的标准很严格 但如果没有找到合适的引物 则标准会自动降低直到找到合 适的引物 下列图表中显示了在PCR 其中Tm值范围是 引物设计中自动搜索初始的严格参数 根据指定搜索范围中所有可能引物的Tm平均值确定的
如果您是搜索测序引物 则相应参数会有所不同 具体列表如下图
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如果您是搜索杂交探针 则相应参数如下图
其他信息 如果您选择手动搜索 并点击Stringency 更新的图表
严格度
按钮
您会得到类似以上的自动
Manual Search 手动搜索 及引物设计原理
在过去十年中 PCR 二级结 为获得高效扩增 方法得到的很大发展 我们对引物稳定性 构和适宜长度的了解使得我们在保证引物特异性的前体下 大大提高了引物的扩增效率 而
PRIMER PREMIER 软件的搜索法则很好的维持了高效性和特异性之间的平衡
引物长度
引物的长度控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度 对越多数实验 适宜引物长 度为18到24个碱基 等于或少于15碱基的短引物有时用于简单的基因作图或特殊的文库构建 library protocol 28到35碱基的长引物对于从一系列高度相关的分子中扩增序列和特殊样
本的克隆能起到重要作用 长PCR 引物能给扩增带来更好的特异性 长引物也允许您通过降低 退火温度来能提高反应的灵敏度 不过长引物通常更易于形成包括发卡结构 二聚体 自身互 补等二级结构
理论上 在合适的融链温度范围内最短的引物能在特异性和高效性间获得较好的平衡
PRIMER PREMIER 已经包含了合适的引物长度范围 如果您改变了它们 软件将会自 动记录并在下次使用 直到您再次改变它们 因此 您最好根据不同实验的特殊要求输入合适 的长度范围
PRIMER PREMIER 以最短的指定长度开始搜索引物 如果找到的引物的Tm值小于设定 范围或GC含量不符合要求 它将给引物增加一个碱基长度并重新计算Tm值和GC含量看其是否
符合要求 如果引物长度达到最大值还不能符合要求 则该引物将会被剔除 这种搜索机制保 证找到的引物是符合Tm值和GC含量要求的最短引物 为设计一条高效引物 有几个参数必须考虑 PRIMER PREMIER搜索所考虑的参数依次 如下
Tm 融链温度
PRIMER PREMIER根据相邻二碱基对作用理论 nearest neighbor theory 来计算融链
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温度 请参看附录A中关于公式的说明 选择的 Tm范围应该为退火提供足够的热度 在自动搜
PRIMER PREMIER 索中 使用的范围选择机制如下
首先 计算出指定搜索范围中所有可能引物的Tm值 得出平均值后 按照不同的严格度
要求确定的波动值 根据这一平均值来计算出Tm范围 根据已发表的实验数据 文献 Tm范围为56到63°PCRC 以上机制是被设 8 反应的合适 计用来保证能在指定的范围内找到合适数量的引物
GC% GC 含量
对于 GC GC PCR反应来说 含量在50%左右比较合适 而对于测序引物和杂交探针来说
含量至少应为50% 请参看上文体参数 Automatic Search章节中的图表标明的各种搜索方法使用的具
Degeneracy 多义性 当设计多义引物时 应尽量减少引物多义性
这样会带来更好的特异性 应尽量避免 3 末端的多义性 因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸Degeneracy 多义性 详情请参看本说明的
章节
3’ End Stability 3 末端稳定性 引物稳定性影响它的错配效率 稳定性较弱的3 末端 一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对 如果引物3 稳定性强
5 末端不配对的情况下造成错 配 形成非特异性扩增条带 secondary bands 有可能在即使
而3 末端稳定性低的引物较好的原因是 在引物发生错配时 由于
3 末端不太稳定 引物结合不稳定 而难以延伸
GC Clamp GC
钳 引物与目的位点的有效结合需要有稳定的
5 末端 5 末端称为钳 它保证引物与模板的稳定结合 这一段有较强稳定性的 选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的
GC 前提下尽量降低退火温度
使用菜单Report > Internal Stability 选项可以看到象下图所显示的 一个引物的内部稳定性曲线表
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请注意 上图就显示一个好的引物 3 末端稳定性较弱 而5 末端有一个较强的GC钳
Repeats and Runs 重复和循环
PRIMER PREMIER自动剔除任何有三个及以上的重复或循环碱基的引物 例如引物包含
ATATAT这样AT被重复三次 那么这个引物将被剔除 您可以设定可以接收的碱基重复的数量
Secondary Structures 二级结构
二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素 二级结构能显著影响反应中能与模板正
确结合的引物数量 发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力从而降低扩增效率 形
成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用
Hairpin 发卡结构 发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构 并 由于发卡结构的形成是分子内的反应 仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成 发卡结构的稳 定性可以用自由能衡量 自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需 要的能量 如果自由能值大于 如果自由能值小于0 则 0 则该结构不稳定从而不会干扰反应
PRIMER PREMIER软件中的 该结构可以干扰反应 按下按钮 All 可以使用 Hairpin Report
功能 帮助您回避类似二级结构
Dimer 二聚体 引物之间的配对区域能形成引物二聚体 它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结 构 它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物 二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向 引物之间形成 如果配对区域在3 末端 问题会更为严重 3 末端配对很容易引起引物二聚
体扩增 使用 Report功能可以预测二聚体的形成 Dimer False Priming 错配 如果引物可以结合除目的位点外的其他区域 扩增效率将明显降低 目的产物带将减少或 出现涂布 smear会检查每一条引物是否会与整个序列的其他位点形成 PRIMER PREMIER 局部的错配 3 末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基
配对 您可以分别设定确认为错配的3 末端或引物全长形成连续碱基配对的数量 Pair Rating 匹配度评分
匹配度低的引物对常常不太有效 是因为 Tm低的引物决定扩增的特 在同样退火温度下 异性 而Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造成错误的起始 PRIMER PREMIER会计算
每一对引物的匹配度 100分为满分 并按照分数按降序排列 计算引物对匹配度以及单个引 物评分的公式请参看本说明的附录
Search Results 搜索结果
当您点击搜索程序窗口的 OK 按钮接受搜索结果后 Search Results 搜索结果 窗
口将会打开 它显示了搜索中找到的所有引物或引物对 如果您选择了一条引物或一对引物对
在PRIMER PREMIER窗口上将即时显示引物的分析结果 与当前的序列配对的引物的位置和 序列也会在Direct Select框上显示
其他信息 Search Results窗口的位置和大小是可以调节的 这样在其他窗口里您感兴趣的显示 内容 如引物分析结果 就不会被遮住了 可选操作
Function > Search Results
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