这种薄膜对蛋白质吸附小，能消除电泳中出现的“托尾”现象。
具有分离速度快、样品用量小的特点。适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。 2.凝胶电泳： 以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）普遍用于分离蛋白质及较小分子核酸。 琼脂糖凝胶电泳适用于分离同工酶及其亚型、大分子核酸等。
3.等电聚焦电泳： 利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术，特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分，在区带电泳中分辨率最好。
常用的pH梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等。 4.毛细管电泳： 利用电泳和电渗流的电动力学原理，在一种空芯的微小内径的毛细管中进行混合物的高效分离技术。
毛细管电泳可分为：毛细管自由溶液区带电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦电泳及胶束毛细管电动力学色谱。
三、离心技术
（一）离心技术的基本原理
离心技术是根据一组物质的密度和在溶液中的沉降系数、浮力等不同，用不同离心力使其从溶液中分离、浓缩和纯化的方法。
离心技术分为制备离心技术和分析离心技术。 制备离心技术主要用于物质的分离、纯化，而分析离心技术主要用来分析样品的组成。 离心力（Fc） Fc= mω2X m是质量（g）
ω是旋转角速度（弧度／s）
X是颗粒离开旋转中心的距离（cm）
相对离心力（RCF）： RCF=1.118×1O-5·n·X n为转子的转数（rpm）
X为离心转子的半径距离（cm）
（二）离心技术种类及在检验中的应用
1. 离心技术在生化检验中的应用主要有两方面：
①对悬浮液中颗粒的分离，如从全血中分离血清、血浆等；
②分离两种密度不同液相，如从有机溶剂和水的混合物中分离出有机相等。 2.种类：
（1）普通离心法： 可用来分离细胞、细胞膜或细胞碎片。
（2）差速离心法（差级离心法）： 原理是交替使用低速或高速离心，也可采用逐渐增加离心速度的办法，通过不断增加相对离心力使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。 由于分辨率不高，常用于定性分离手段之前的粗制品提取。 3.密度梯度离心法： 比差速离心法复杂，但该法具有很高的分辨率，可以同时使样品中的各个组分得到分离。 其做法是将样品放在密度梯度介质中进行离心。可分为：
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1）速率区带离心法：
根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。
离心前在离心管内装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。
离心后在近旋转轴处的介质密度最小，离旋转轴最远处介质的密度最大。 一般用于分离大小相异而密度相同的物质。
2）等密度区带离心法： 离心前预先配制介质的密度梯度，待分离的样品铺在梯度液顶部或与梯度液混合，当梯度液由于离心力作用逐渐形成低浓度而管顶稀的密度梯度，同时，原来分布均匀的粒子也发生重新分布。
当管底介质的密度大于粒子的密度时，粒子上浮。此法常用于分离大小相似而密度差异较大的物质。
4.分析性超速离心 主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，如测定大分子的相对分子量、生物大分子的纯度估计、分析生物大分子中的构象变化等。
四、层析技术 （一）原理
层析法是利用待分离物质不同物质理化性质的差异而建立起来的一种分离分析技术。 所有的层析系统都由固定相和流动相组成。 固定相：是固体物质或是固定于固体上的成分。 流动相：由水和各种溶媒组成（液体或气体）。 当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。 （二）层析法分类
而按层析原理还可将层析分为： 1.凝胶层析： 又称分子筛过滤、凝胶过滤或排阻层析等。 固定相是多孔凝胶构成。
根据物质分子大小不同，随流动相通过凝胶时受阻滞的程度（移动速度）不同得以分离。 优点： 所用凝胶属于惰性载体，吸附力弱，不损伤样品；
重复性好，有利于定性；
操作条件温和，不需要有机溶剂，对高分子物质有很好的分离效果。
常用的凝胶有Sephadex G（葡聚糖凝胶）系列。 凝胶层析可用于脱盐、分离提纯、测定高分子物质的分子量、高分子溶液的浓缩等。
液体 液体 固体 液-液层析 液-固层析 气-液层析 气-固层析 气体
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2.离子交换层析： 采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。
主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。
3.高效液相层析（HPLC）： 在经典液相层析法基础上，引进气相层析的理论而发展起来的一项新颖快速的分离技术。
具有分离能力强、测定灵敏度高、可在室温下进行、应用范围广等优点，对分离蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤其有利，根据流动相和固定相相对极性，高效液相色谱分析可分为正相和反相两种。 4.亲和层析： 利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。 将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。
改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。
亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。
具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。
亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。
五、电化学分析技术 （一）基本原理
利用物质的电化学性质，测定化学电池的电位、电流或电量的变化进行分析的方法称为电化学分析法。
（二）离子选择性电极分析法
离子选择电极（ISE）能对某特定离子产生响应，在一定范围内，其电位与溶液中特定离子活度的对数呈线性关系，因此可用离子选择电极来定量分析某些离子的活度或浓度，临床上常被用于多种体液（血、尿、唾液、脑脊液等）中Ca2+、K+、Na+、Cl-、F-和碳酸氢盐等离子测定。
使用离子选择性电极电位分析法测定的是离子活度a，而一般分析中要求测定的是离子浓度c，二者关系为：a=f·c，其中f为活度系数，是溶液中离子强度的函数。。 在稀溶液中活度系数f≈1时，a=c，活度可代表浓度。 高浓度测定时，通常在标准溶液和样品溶液中分别加入浓度很大的对待测离子无干扰的电解质，作为总离子强度调节缓冲剂，使标准溶液与待测溶液离子强度达到一致，并有缓冲及消除干扰的作用。
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习题：
发射光谱分析法是下列哪类测定法的原理 A.火焰光度法
B.离子选择电极法 C.化学比色法
D.免疫比浊法 E.放射免疫法
[答疑编号500727140101] 『正确答案』A
2.用于分离不同分子大小的蛋白质的方法是（ ）。 A.琼脂糖凝胶电泳 B.凝胶层析 C.速率免疫比浊法 D.免疫固定电泳 E.普通离心
[答疑编号500727140102] 『正确答案』 B
第二节 实验方法的选择
生物化学检验是利用各种检测技术和方法，研究人体组织、体液的各种成分及其含量，为临床疾病预防、疾病诊断、病情监测、疗效评价、预后判断提供准确可靠的信息。 选择准确可靠的实验方法是提供准确可靠信息的重要中心环节之一。
一、实验方法选择的目的
1.各实验室按照方法选择的原则结合自身条件，确定合适的某项目的检测方法。 2.保证拟使用的检测方法在正式应用于临床分析病人标本之前，对方法分析性能及可能引入的误差进行了解，作出初步评估。
二、实验方法的分级
国际临床化学联合会（IFCC）根据分析方法的准确性与精密度的不同，将其分为决定性方法、参考方法和常规方法三级。
（一）决定性方法（definitive method）
决定性方法准确度最高、系统误差最小、几乎无干扰的方法。
其测定结果与“真值”最为接近。主要方法有重量分析法、中子活化法、同位素稀释-质谱分析法（ID-MS）等。
由于技术要求太高，费用昂贵，因而这类方法不直接用于鉴定常规方法的准确性，只用于评价和发展参考方法与一级标准品。 国际上研究这类方法的实验室很少，美国、法国、德国、丹麦等国家有这类实验室。 （二）参考方法（reference method）
参考方法是指准确度与精密度已经被充分证实，且经公认的权威机构（国家主管部门、相关学术团体和国际性组织等）颁布的方法。
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这类方法干扰因素少，系统误差很小，有适当的灵敏度、特异度、较宽的分析范围并且线性良好，重复测定中的随机误差可以忽略不计。 参考方法能在条件优越的实验室作常规分析，主要用于鉴定常规方法，评价其误差大小、干扰因素并决定是否可以被接受；
用于鉴定二级标准品和为质控血清定值；用于商品试剂盒的质量评价。 （三）常规方法（routine method）
指性能指标符合临床或其他目的的需要，有足够的精密度、准确度、特异性和适当的分析范围，且经济实用。 其中准确度已经确定即已查明偏差方向和数量的方法称为偏差已知方法，而准确度不明者称为偏离未知方法。
常规方法经有关学术组织认可，可以作为推荐方法，用于常规实验室检测。
三、标准试剂的分级
标准品（参考物）定义：它是一种或几种物理或化学性质已经充分确定，被用于校正仪器或证实某种测定方法的物质。
标准品是进行方法评价、仪器校正、常规分析的质量控制等不可缺少的，在临床化学中将其分为三级。
（一）一级标准品（原级参考物） 它是已经确定的稳定而均一的物质，其数值已由决定性方法确定或由高度准确的若干方法确定，所含杂质已经定量。
一级标准品都有证书，在美国由国家标准局（WBS）颁发证书，并指明其性质和有关数据。
一级标准品用于校正决定性方法，评价和校正参考方法以及为“二级标准品”定值。 （二）二级标准品（次级参考物） 这类标准品可以是纯溶液（水或有机溶剂的溶液），也可以存在于相似基质中。 可由实验室自己配制或为商品，其中有关物质的量由参考方法定值或用一级标准品比较而确定。
二级标准品主要用于常规方法的标化和控制物的定值。 （三）控制物
控制物用于常规质量控制，以控制病人标本的测定误差。 有定值血清和未定值血清两种。 控制物不能用于标定仪器或方法。
在控制物的制备、定值和使用过程中，应严格按有关规程进行。”
四、实验方法选择的原则
实验方法选择要从实际出发，根据实验室的条件和检测要求确定适当的方法。
条件优越的实验室应建立和选择参考方法，以利于对常规方法的评价和标准品的定值； 一般临床化学实验室应结合仪器设备、技术力量、实验成本等因素，主要选择常规分析方法和使用方便的参考方法。
选择常规分析方法时，尽量选用国内外通用方法或推荐方法，便于方法的规范化和质量控制，要重点考虑实用性和可靠性两方面的性能指标。 （一） 实用性 一般应具备微量快速，方法简便，安全可靠，成本低廉。 1.微量快速 便于急诊，适合批量成套分析。快速即检测速度，是指一份标本操作一次
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