（二）抗酸染色
1.原理
分枝杆菌细胞壁含脂质较多，其中主要成分为分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色时与石炭酸复红结合牢固，能抵抗酸性乙醇的脱色作用，因此抗酸菌能保持复红的颜色，达到染色目的。
2.方法
（1）萋纳石炭酸复红染色，加温促使菌体着 色5min；
（2）流水冲洗，3%盐酸酒精脱色1~3min； （3）吕氏美蓝复染30s
三、生化反应
（一）碳水化合物的代谢试验
1.糖（醇、苷）类发酵试验
原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。
结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。不分解糖则无变化。
2．葡萄糖代谢类型鉴别试验（O-F试验）
原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。
结果：培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；培养基表面和底部都产酸（变黄）为发酵型；培养基表面变为深蓝色为产碱型；培养基表面变黄、底部不色变为氧化型。
3．甲基红（MR）试验 原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培养基pH下降至4.5以下时，加入甲基红指示剂呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基pH在5.4以上，加入甲基红指示剂呈桔黄色
结果判定：呈现红色者为阳性，桔黄色为阴性，桔红色为弱阳性。
4．Β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
原理：乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。有些细菌只有半乳糖苷酶，因而只能迟缓发酵乳糖，所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黄色的邻硝基酚。用于枸橼酸菌属、亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别。
结果：呈现亮黄色为阳性，无色为阴性。 应用：可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定，本法对于迅速及迟缓分解乳糖的细菌均可
短时间内呈现阳性。埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷菌属和肠杆菌属等均为试验阳性，而沙门菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。
5．VP试验
原理：测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。某些细菌如产气肠杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等含胍基的物质结合形成红色化合物。即V-P试验阳性
结果：红色者为阳性，黄色或类似铜色为阴性
应用：主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。本试验常与MR试验一起使用，一般情况下，前者为阳性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。
6．胆汁七叶苷水解试验
原理：在10%~40％胆汁存在下，测定细菌水解七叶苷的能力。七叶苷被细菌分解生成的七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子发生反应形成黑色化合物。。
结果：培养基完全变黑为阳性，不变黑为阴性。
应用：主要用于鉴别肠球菌与其他链球菌的区别，以及肠杆菌科的某些种、某些厌氧菌（如脆弱拟杆菌等）的初步鉴别。肠球菌本试验为阳性。
（二）细菌对于蛋白质和氨基酸的代谢试验
1.明胶液化试验
原理：某些细菌可产生一种胞外酶-明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体的明胶培养基成为流动的液体。
结果：培养基呈液化状态为阳性。
应用：肠杆菌科细菌的鉴别，如沙雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟杆菌等可液化明胶，而其他细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。另外多数假单胞菌也能液化明胶。
2.吲哚（靛基质）试验
原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚（靛基质），当加入吲哚试剂（对二甲氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚。
培养基：蛋白胨水培养基。
结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。 3.硫化氢试验
原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）产生硫化氢，硫化氢遇铅或亚铁离子则形成黑褐色的硫化铅或硫化铁沉淀。此试验可间接检测细菌是否产生硫化氢。
培养基：醋酸铅培养基。
结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。
应用：主要用于肠杆菌科中属及种的鉴别。如沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属细菌，绝大多数硫化氢阳性，其他菌属阴性。沙门菌属中也有硫化氢阴性菌种。
4.尿素分解试验
原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性。 培养基：尿素培养基。
结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。奇异变形杆菌和普通变形杆菌脲酶
阳性。另外雷氏普罗威登菌和摩根菌为阳性，而斯氏和产碱普罗威登菌阴性。
5.苯丙氨酸脱氨酶试验
原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，加入氯化铁试剂后产生绿色反应。
培养基：苯丙氨酸琼脂培养基。
结果：出现绿色为阳性。应立即观察结果，延长反应时问会引起褪色。
应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌种中其他细菌均为阴性。
6.氨基酸脱羧酶试验
原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺（赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和二氧化碳，使培养基变碱。使指示剂显示出来。
培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基。
结果：孵育后，对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性；若测定管呈黄色为阴性。若对照管呈现紫色则试验无意义，重新做试验。
应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均为阴性。
（三）碳源和氮源利用试验
1.枸橼酸盐利用试验
原理：某些细菌能以铵盐为唯一氮源，并且利用枸橼酸盐作为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱性。
培养基：枸橼酸盐培养基。 结果：培养基中的溴麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性；不能利用枸橼酸盐作为碳源的细菌，在此培养基上不能生长，培养基则不变色，为阴性。
应用：用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。在肠杆菌科中埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常为阳性。
2.丙二酸盐试验
原理：丙二酸盐是三羧酸循环中琥珀酸脱氢酶的抑制剂。能否利用丙二酸盐，也是细菌鉴定中的一个鉴别性特征。许多微生物代谢有三羧酸循环，而琥珀酸脱氢是三羧酸循环的一个环节，丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶，与丙二酸不被分解，所以琥珀酸脱氢酶被占据，不能释放出来催化琥珀酸脱氢反应，抑制了三羧酸循环。
观察结果：如测定培养基生长并变蓝色，表示可利用丙二酸盐，为阳性结果；如测定培养基未变色，则为阴性，即不利用丙二酸盐。
2.丙二酸盐利用试验
（1）原理：有的细菌可利用丙二酸盐作为唯一碳源，将丙二酸盐分解生成碳酸钠，使培养基变碱。
（2）培养基：丙二酸盐培养基。
（3）结果：培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，颜色无变化为阴性
（4）应用：肠杆菌科中属间及种的鉴别。克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性，其他菌属均为阴性。
（四）氧化酶试验
原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的
细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。
结果：细菌在与试剂接触10秒内呈（二甲基对苯二胺盐酸盐为紫红色，四甲基对苯二胺盐酸盐为蓝色）为阳性。分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。
应用：主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别，前者为阴性，后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。
（五）触酶试验
原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。
结果：有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。
应用：革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。
（六）硝酸盐还原试验
原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。但硝酸盐还原的过程因细菌不同而异，有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌；有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如假单胞菌等。硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生的亚硝酸。
培养基：硝酸盐培养基。
试剂：甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol／L醋酸100ml；乙液（α-奈胺0.5g+5mol/L醋酸100ml）。
结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，可能是： 1.硝酸盐没有被还原，试验阴性；
2.硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴性。
若要检查是否有氮气产生，可在培养基管内加一小倒管，如有气泡产生，表示有氮气生成医`学教育网搜集整理。
应用：本试验在细菌鉴定中广泛应用。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等假单胞菌可产生氮气；有些厌氧菌如韦荣球菌等试验也为阳性。
（七）DNA酶试验
原理：某些细菌产生DNA酶，可使长链DNA水解成寡核苷酸链。因为长链DNA可被酸沉淀，寡核苷酸链则溶于酸，所以当菌落平板上加入酸后，会在菌落周围出现透明环。
结果：在菌落周围出现透明环为阳性，无透明环为阴性。 应用：在革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生DNA酶，在肠杆菌科中沙雷菌和变形杆菌产生此酶，故本试验可用于细菌的鉴别。
（八）凝固酶试验
原理：葡萄球菌可产生两种凝固酶。一种是结合凝固酶，结合在细胞壁上，使血浆中的纤维蛋白原变成纤维蛋白而附着于细菌表面，发生凝集：可用玻片法测出。另一种是分泌至菌体外的游离凝固酶。作用类似凝血酶原物质，可被血浆中的协同因子激活变为凝血酶样物
质，而使纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而使血浆凝固，可用试管法测出。
结果：玻片法以血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象判为阳性；试管法以血浆凝固判为阳性。
应用：作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。
（九）CAMP试验（ChristisAtkins&Munch-PetersonTest,CAMP）
原理：B群链球菌能产生CAMP因子，可促进葡萄球菌的β–溶血素溶解红细胞的活性，因此在两菌（B群链球菌和葡萄球菌）的交界处溶血力增加，出现矢状（半月形）的溶血区。。
应用：在链球菌中，只有B群链球菌CAMP试验阳性，故可作为特异性鉴定。
微生物检验的质量保证（qualityassurance，QA） 检验前的质量保证
检验前程序，又叫分析前期，指从临床医生开医嘱开始，到分析检验程序启动时终止的步骤，包括
检验申请
标本的采集与运送
检验申请
患者姓名、出生日期、病房和床号、年龄和性别 临床表现及当前所用抗菌药物 相关旅行史 标本来源 检验项目
感染类型或目标微生物
标本采集时间、实验室收到标本时间
标本的采集
原始标本采集手册，包括 患者准备
不同部位标本的采集方法 标本运送要求
延迟运送时标本的贮藏方法 安全运送标本的方法 标本标识
标本采集指南应方便标本采集、运送者取阅 标本的运送与接收
标本运送：根据申请检验项目的性质；标本采集指南规定的运送时间、运送条件、运送培养基；安全运送标本方法以及国家、地区及当地相关法规要求进行监控。
标本接收：制定并执行标本接收或拒收标准，包括合适的标本类型、标本量、运送条件、预防拭子干燥、运送培养基等。
缺乏正确标识的标本：一般不接收或处理；
若被检测物质不稳定，并且标本不可替代或很重要，可以先处理，待申请医师或标本采