第二部分 生物药物制备实验
第一节 氨基酸及其衍生物类药物
实验二十二 固定化细胞法生产L-天冬氨酸和L-丙氨酸
注：此实验来自项目固定化细胞生产天冬氨酸，丙氨酸（国家攻关课题）的成果 【实验目的】
1．学习L-天冬氨酸和L-丙氨酸的制备方法。
2．了解酶法生产这两种氨基酸的原理和细胞固定化的原理及优点。 3．掌握固定化细胞的技术。
【实验原理】
固定化细胞（Immobilized cell）技术，就是利用物理或化学手段将游离的微生物细胞、动物细胞，定位于限定的空间领域，并使其保持活性且能反复利用的一项技术。
固定化细胞的制备方法主要有以下几种：吸附法、共价交联法、絮凝法、包埋法；交联可以是细胞通过离子相互作用或共价连接到一个表面，也可以是细胞与细胞之间用过天然或化学试剂诱导产生连接；吸附法是细胞通过静电相互作用（范德华力、离子键和氢键）吸附到支持物表面，此法简单价廉，但经常发现有细胞泄露；絮凝法是利用某些微生物细胞具有絮凝形成颗粒的能力而对细胞进行固定化的方法；包埋法是近年来发展迅速的一种新兴固定化细胞技术，它是将细胞捕获在一个保护性基质结构或胶囊中，减少了细胞泄露，因此具有操作简单，对细胞活性影响较小，效率高等特点，是目前细胞固定化研究和应用最广泛的方法之一。
L-天冬氨酸（L-Aspartic acid）是天然存在的重要氨基酸，在食品、医药、日用化工、纺织等行业有着广泛的应用。L-天门冬氨酸钾、镁盐在细胞代谢中起着重要作用，是钾、镁的有效补充剂，适用于各种心脏病。在食品方面，L-天冬氨酸作为食品添加剂可改善食品风味，L-天冬氨酸与D-丙氨酸可合成L-天冬酰-D-丙氨酸甲酯（其甜度为蔗糖的150倍），是一种新型甜味剂。在化工方面，L-天冬氨酸还可以作为制造合成树脂的原料，其衍生物还可以合成量型表面活性剂以及制造化妆品。
工业上生产L-天冬氨酸以往采用化学合成法和微生物发酵法。随着固定化酶和固定化细胞技术的不断完善和发展，人们开始改用含有天冬氨酸酶的固定化细胞直接将延胡索酸铵转化成L-天冬氨酸来实现工业化生产。
L-丙氨酸（L-Alanine）是一种脂肪族的非极性氨基酸，是丙酮酸代谢体系的非必需氨基酸，在血液中含量最多，与糖代谢密切相关，使转氨反应中重要的氨基供体，具有重要的生理功能；同时又是一种重要的氨基酸类药物，为多种复方氨基酸输液的重要组成成分，并可作多种医药中间体。
本实验用卡拉胶包埋天冬氨酸酶产生菌和L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌制成固定化细胞，利用生物反应器，可连续生产L-天冬氨酸和L-丙氨酸。
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【实验材料】
1．器材
（1）水浴振摇培养箱 1台 （2）磁力搅拌器 1台 （3）HPLC 1台 （4）三角烧瓶 250 ml 5个 （5）抽滤瓶 1个 （6）离心机 1台 （7）布式漏斗 2只 （8）恒温水浴锅 1台 （9）酶柱 1根 （10）烧杯 1 000ml 1个 （11）烧杯 500ml 2个 （12）烧杯 250ml 2个 （13）超级恒温水浴 1台 （14）恒流泵 1台 （15）高压灭菌锅 1个 （16）锋利小刀 1把 （17）试管 12支 2．试剂
（1）菌种 （2）玉米浆
（3）延胡索酸铵
（4）PLP（5-磷酸吡哆醛） （5）牛肉浸膏 （6）KH2PO4 （7）MgSO4·7H2O （8）浓氨水 （9）氯化钾 （10）氯化镁 （11）浓硫酸 （12）95％乙醇
（13）Ｌ-天冬氨酸标准品 （14）延胡索酸标准品 （15）Ｌ-丙氨酸标准品
【实验方法】
1．细菌的培养及菌体制备
接种1ml对数生长期天冬氨酸酶产生菌种至250ml三角烧瓶中，内含50ml已经灭菌的
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培养基(1%延胡索酸铵， 2%玉米浆，2%牛肉浸膏，0.5%KH2PO4，0.05%MgSO4?7H2O，pH7.0)，37℃振摇培养24h，培养液离心（3 000r/min，20min）倾出上清液，再用生理盐水洗涤1次，离心收集菌体，置冰箱备用。
接种1ml对数生长期L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌种至250ml三角烧瓶中，内含50ml已灭菌的培养基（1.5%L-谷氨酸钠，0.5%富马酸铵，1%富马酸钠，3.0%玉米浆，2%蛋白胨，0.05% KH2PO4，0.01%MgSO4?7H2O，pH7.0），37℃振摇培养24h，培养液离心（3 000r/min，20min）倾出上清液，再用生理盐水洗涤一次，离心收集菌体，置冰箱备用。 2．固定化细胞的制备
（1）天冬氨酸酶产生菌的固定化
将4g湿菌体悬浮于4ml生理盐水中，置45℃恒温水浴保温，0.8g卡拉胶于17ml生理盐水中，加热至70-80℃使之溶解，再降温至45℃，两者于45℃混匀，混合物置4℃冰箱放置30min，将凝胶在100ml 0.3mol/L KCl溶液中浸泡4h，然后切成3mm×3mm×3mm的立方体颗粒。经生理盐水洗涤后，将固定化细胞置于1mol/L延胡索酸铵中，于37℃活化24h，即可使用。
（2）L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的固定化
将5g湿菌体悬浮于5ml生理盐水中，置45℃恒温水浴保温，0.8g卡拉胶于17ml生理盐水中，加热至70-80℃使之溶解，降温至45℃，两者于45℃混匀，混合物置4℃冰箱放置30min，将凝胶在100ml 0.3mol/L KCl溶液中浸泡4h，然后切成3mm×3mm×3mm的立方体颗粒。用0.1mol/L甘氨酸充分洗涤，在1mol/L天冬氨酸铵（含0.1mol/LPLP）底物中，于37℃活化24h，即可使用。 3．酶活力测定
（1）湿菌体天冬氨酸酶活力的测定
取0.5g湿细胞悬浮于2ml蒸馏水中，加入30ml 1.0mol/L延胡索酸铵，内含1mmol/L MgCl2，1%Triton pH 9.0，37℃搅拌反应30min，煮沸终止反应，1200rpm,5min离心后，稀释反应上清液于240nm处测定吸收值，按延胡索酸残余量计算酶活力，一个酶活力单位定义为在测定条件下，每小时每克细胞转化生成1μmol天冬氨酸所需的酶量。
（2）固定化细胞的天冬氨酸酶活力的测定
取相当于0.5g天然细胞的固定化细胞， 置于30ml 1.0mol/L延胡索酸铵，内含1mmol/L MgCl2，37℃搅拌反应30min，迅速过滤除去固定化细胞，分离反应液，经稀释后于240nm处测定延胡索酸残余量，并计算每克固定化细胞的酶表现活力。总活力用每克固定化细胞，单位小时内所产生的L-天冬氨酸的微摩尔数表示（μmol/h·g·cell）。
（3）延胡索酸（即富马酸）标准曲线的绘制
延胡索酸在240nm处有特征峰吸收，在一定范围内与延胡索酸含量成线性关系，且反应系统中无干扰。
标准曲线的绘制
试管号
延胡索酸标准液（50μg/ml）
1 0 5
2 1 4
3 2 3
4 3 2
5 4 1
6 5 0
蒸馏水 OD240nm
根据测定的吸收值，作出标准曲线或回归方程。
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（4）湿菌体L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌活力的测定
取1g湿菌体悬浮于10ml生理盐水中，取0.5ml悬浮液，加入含0.1mmol/L PLP的1mol/L天冬氨酸铵的底物2ml（pH6.0）于37℃反应30min，煮沸终止反应。生成的L-丙氨酸用纸层析法定量测定。
展开剂选用正丁醇:醋酸:水=4:1:1，显色剂用0.5%茚三酮溶液，烘干后，将显色斑点剪下用0.1%CuSO4·5H2O:75%乙醇=2:38洗脱后，于520nm处比色，再从标准曲线上读得L-丙氨酸的含量。L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌活力的的定义为：每克细胞每小时生成1μmol /L-丙氨酸为1个酶活力单位（U）。
（5）固定化细胞的L-天冬氨酸β-脱羧酶活力的测定
取6g固定化细胞（相当于1g的湿细胞）加入20ml生理盐水，于37℃保温，加入含0.1mmol/L PLP的1mol/L L-天冬氨酸铵4ml，pH6.0，于37℃反应30min，迅速过滤除去固定化细胞，分离反应液，生成的L-丙氨酸用纸层析法定量测定。
（6）L-丙氨酸标准曲线的绘制 按（5）法用纸层析法定量测定L-丙氨酸的含量与显色斑点脱色后在520nm处比色的关系。
标准曲线的绘制
试管号
L-丙氨酸标准液（40μg/ml）
1 0 5
2 1 4
3 2 3
4 3 2
5 4 1
6 5 0
蒸馏水 OD520nm
根据测定的吸收值，作出标准曲线或回归方程。 4．L-丙氨酸的制备
分别将6g天冬氨酸酶和L-天冬氨酸β-脱羧酶的固定化细胞装入带夹套的固定化生物反应器内（Φ1.5cm×30cm），1.0mol/L延胡索酸铵（含1mmol/L MgCl2，pH9.0）底物，以恒流速度通过天冬氨酸酶固定化细胞柱，SV=0.87h-1，然后将流出液通过L-天冬氨酸β-脱羧酶固定化细胞柱，并加0.1mmol/L PLP和28%的氨水，使pH6.0，流出液用纸层析法计算L-丙氨酸的量，并计算转化率（L-丙氨酸转化率=L-丙氨酸浓度/延胡索酸铵浓度×100%）。
【思考题】
１．分别求出湿菌体天冬氨酸酶活力、固定化细胞的天冬氨酸酶活力及湿菌体L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌活力、固定化细胞的L-天冬氨酸β-脱羧酶活力。 ２．分别求出两种菌体包埋后的活力回收率。 ３．分别求出L-天冬氨酸和L-丙氨酸的转化率。
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第二节 多肽及蛋白质类药物
实验二十三 重组水蛭素Ⅲ的制备
注：此实验内容来自校企合作课题，部分成果已申请专利
【实验目的】
1．了解以基因工程菌种E.coli/pHV3为材料进行工程菌发酵培养、外分泌表达小分子多肽类药物重组水蛭素Ⅲ及表达蛋白制备和抗凝血酶活力测定、SDS-PAGE电泳分析鉴定的工作原理。
2．掌握基因工程菌发酵培养条件、分泌表达目的蛋白及表达蛋白分析鉴定的操作技术方法。
【实验原理】
水蛭素(hirudin)是一类由医用水蛭(Hirudo)唾液腺中分泌出的低分子量的酸性单链多肽， 1904年，Markwardt首先将其分离纯化，并于1970年确定它是迄今发现的最强的凝血酶特异性抑制剂，即使在较低的浓度也可充分地阻止血液的凝固。药理学及临床研究表明，水蛭素能有效地预防静动脉血栓的形成及弥散性血管凝结，不引起过敏、免疫反应，不会造成循环功能障碍。可用于治疗不稳定性心绞痛(USA)、急性心肌梗死(AMI)、血管成形术、术后血栓形成、血液透析、体外循环、弥散性血管内凝血(DIC)等，是很好的抗凝抗栓药物。
水蛭素的分子质量约为7 000Da，含有65～66个氨基酸残基，水蛭素肽链的二级和三级结构对其抗凝活性起决定性作用，其N端的3个二硫键则是决定分子二级和三级结构及其稳定性的关键，将二硫键氧化，或分子发生蛋白降解，则失去抗凝活性。若Ｃ端羧基被酯化，或失去Ｃ端氨基酸，也会失去与凝血酶结合的能力。
水蛭素干燥状态下稳定，室温下水中可稳定存在6个月，80℃下加热15 min不被破坏。pH值升高则稳定性下降，在0.1 mol/L盐酸溶液或0.1 mol/L氢氧化钠溶液中可稳定15 min。水蛭素不被胰蛋白酶水解，对α-糜蛋白酶也有一定的耐受性，但番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A则可使之失去活性。
由于天然水蛭素来源非常困难，每条水蛭只含20μg的水蛭素，不能满足临床应用。为此，国外多家公司及研究单位从80年代末就开始研究采用基因工程技术生产重组水蛭素。目前，在国外已上市的水蛭素产品有Hoechs公司的重组水蛭素(Lepirudin,商品名Refludon)，Novartis公司的重组水蛭素产品(Desirudin)。1997年，本院合成了重组水蛭素Ⅲ基因并构建了大肠杆菌外分泌表达体系，分泌型重组水蛭素Ⅲ基因工程菌的表达产物重组水蛭素Ⅲ（recombine hirudin Ⅲ, 简写为rHV3）相对分子质量为7 010.8Da。
此工程菌为外分泌表达体系，其基因表达产物rHV3易于纯化。但该表达系统会产生一些杂质蛋白和色素，影响下游的分离纯化。提取纯化工艺采用了大孔吸附树脂疏水层析和离子交换层析方法较好地解决了杂质蛋白和色素的分离。大孔吸附树脂作为rHV3的第一个提取步骤，高分子量杂蛋白被基本去除，而离子交换则是去色素的关键。吸附及离子交换时采用合适的洗脱条件是提高活力收率的重要因素。该纯化方法工艺简单、rHV3收率和纯度均较高，适用于rHV3的大规模制备。
本实验以此工程菌为材料，先进行工程菌发酵培养，再将发酵液经离心，从工程菌发酵液上清中分离纯化rHV3。发酵上清液经过大孔吸附树脂HP20处理后，用DEAE-52阴离子纤维素交换层析，得到较高纯度表达产物rHV3。rHV3进行抗凝血酶活力分析和15%SDS-PAGE电泳分析。rHV3生物活性的测定参照Markwardt的凝血酶滴定方法进行。
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