比活力测定方法为：精确称取纯化产物10mg，溶解于1 ml H2O中，采用Lowry法测定蛋白质含量，并测定抗凝血酶活力，rHV3比活力=抗凝活力(ATU)/蛋白含量。
【实验材料】
1．器材
（1）玻璃层析柱：1.6 cm×20cm或/和2.6 cm×40cm 1套 （2）恒流泵 1台 （3）自动部分收集器 1台 （4）记录仪 1台 （5）恒温水浴锅 （6）高速台式离心机 （7）冷冻离心机 （8）旋涡混合器 （9）752紫外分光光度计 （10）稳压电泳仪 （11）摇床 （12）垂直板式电泳槽 （13）电炉 （14）秒表 （15）高压灭菌锅 （16）电磁搅拌器 （17）酸度计 （18）发酵罐 （19）微量移液器（20μl，200μl，1 000μl） （20）标准净化工作台 （21）真空泵和真空干燥器 （22）电子天平(精确到10mg) （23）照相器材 （24）基因工程菌菌种：E.coli/pHV3为本实验室保存
（25）大孔吸附树脂HP20 （26）DEAE-52阴离子纤维素 （27）Eppendorf离心管架 （28）96孔酶标板 （29）脱色摇床 （30）灭菌的移液器枪头 （31）灭菌的Eppendorf管（1.5ml微量离心管） （32）试剂瓶（5 000 ml，1 000 ml，500 ml，250 ml，100 ml） （33）量筒（2 000 ml，1 000 ml，100 ml，10 ml） （34）烧杯（2 000 ml，1 000 ml，500 ml，250 ml，50 ml） （35）布氏漏斗（8 cm 1只）和吸滤瓶（1 000 ml） （36）滤纸 （37）玻棒 （38）试管(5ml，150支；15ml，16支)
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1台 1台 1台 1台 1台 1台 1台 1套 1只 1只 1台 1台 1台 1台 各1支 1台 1套 1台 1套 若干 若干 1只 1只 1台 若干 若干 若干 各1只 各3只 各1只 若干 2根 （39）三角瓶（250 ml） 2只 （40）大塑料桶 1只 （41）石英比色杯 1对 2．试剂
重组水蛭素Ⅲ制备和抗凝血酶活力：
（1）培养基：
种子培养基（LB 液体培养基）：1% 胰蛋白胨（Tryptone），0.5% 酵母提取物（Yeast Extract），1% NaCl，加蒸馏水配制，pH 7.0，分装，高压蒸汽（1.03×105Pa）灭菌20 min。接种前在无菌条件下加入抗生素，氨苄青霉素的终浓度为100μg/ml。
发酵培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，4%谷氨酸钠，10%麦芽汁。pH6.5，摇瓶装液量为12%；
（2）氨苄青霉素(Amp)；
（3）0.5%牛血纤维蛋白原：0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制； （4）凝血酶溶液：500 NIH单位加5 ml蒸馏水； （5）低分子量标准蛋白(17. 5～94 K Da)； （6）20 mmol/L乙酸； （7）盐酸；
（8）异丙醇；
（9）20 mmol/L哌嗪； （10）氯化钠；
（11）三（羟甲基）胺基甲烷（Tris）； （12）乙醇； （13）氢氧化钠；
（14）谷氨酸钠（或含99%谷氨酸钠的味精）； 15%SDS-PAGE电泳分析： 同实验九。
【实验方法】
1．工程菌发酵培养
（1）从平板上挑取菌种接种于新鲜的含氨苄青霉素(终浓度为60 μg/ml)的LB液体培养基中，37℃，摇床转速220r/min，培养18h。 （2）摇瓶培养：再按3%接种量转接于发酵培养基中，37℃，250 r/min，30h，离心收集上清。
（3）补料-批式发酵：30L的发酵罐装入15L发酵培养基，初始pH值为6.5，121℃下灭菌20 min，待温度降至37℃时加氨苄青霉素至最终浓度为60μg/ｍl，接入种子液1 000ml，37℃培养，调节搅拌速度及通气量，控制溶氧在10～20%，通过补充酸、碱物质控制pH在6.0～7.5，同时通过流加葡萄糖或蛋白胨调节培养基中营养成分，延长活力表达时间。培养9～16h。
2．重组水蛭素Ⅲ分离纯化制备 （1) 发酵上清液制备
下罐后发酵液经12 000 r/min高速离心除去菌体，收获发酵上清液。采用Lowry法和Markwardt的凝血酶滴定法分别检测目的蛋白重组水蛭素Ⅲ含量和活性及进行15%SDS –PAGE电泳分析。计算收率。
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（2) 大孔吸附层析
大孔吸附树脂HP20处理装柱，用20 mmol/L乙酸平衡。调节发酵上清液pH值至5.0～6.0，于抽气泵中脱去气泡，以1ml/min的流速将样品上柱。依次用20 mmol/L乙酸洗涤和50 mmol/L pH8.5 Tris-HCl洗涤，再用含10～40%异丙醇的20 mmol/L乙酸梯度洗脱，分部收集器收集，1.5ml/min，每管收集6ml， 测定每管的A280值和重组水蛭素Ⅲ活性，绘制洗脱曲线。收集显示活性组分，检测重组水蛭素Ⅲ含量和活性及进行15%SDS-PAGE电泳分析。计算收率。
大孔吸附柱处理方法：首先用蒸馏水漂洗，去除漂浮的细小颗粒，再用95%乙醇反复浸泡使其充分溶胀和初步除杂。然后用95%乙醇在布氏漏斗中淋洗至乙醇在254nm的紫外吸收值小于0.03为止。再用蒸馏水洗尽乙醇。最后分别用5%盐酸和5%氢氧化钠浸泡3h，均分别洗至pH值为中性。 （3) DEAE-52阴离子交换柱层析
DEAE-52阴离子纤维素柱经20 mmol/L哌嗪平衡。 大孔吸附层析产物液样品经10 mmol/L哌嗪调节至pH6.0后上样。用平衡缓冲液洗涤至基线平稳。再用含0.1～0.4 mol/L NaCl的20 mmol/L哌嗪(pH6.0) 溶液梯度洗脱，分部收集器收集，1.5ml/min，每管收集6ml， 测定每管的A280值和重组水蛭素Ⅲ活性，绘制洗脱曲线。收集显示活性组分，冷冻干燥后即得高纯度的重组水蛭素Ⅲ冻干粉。检测重组水蛭素Ⅲ含量和活性及进行15%SDS-PAGE电泳分析。计算收率。 3．重组水蛭素Ⅲ生物活性测定
于酶标板小孔中加0.5% 牛血[0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制]200μl，再加入重组水蛭素Ⅲ溶液10～100μl，充分混匀。用微量进样器吸取标准的凝血酶溶液(100 NIH单位)，时间间隔为1 min，若在1 min内纤维蛋白原发生凝固，即说明已达滴定终点。由凝血酶的消耗量换算出重组水蛭素Ⅲ的单位数。由于水蛭素与凝血酶是1:1结合，故每消耗一个凝血酶单位(NIH)相当于一个抗凝血酶单位(ATU)。
4．重组水蛭素Ⅲ比活力测定方法
精称纯化产物10mg，溶解于1 ml H2O中，采用Lowry法测定蛋白质含量，并测定抗凝血酶活力，经以下公式换算即得单位质量的rHV3比活力。rHV3比活力=抗凝活力(ATU)/蛋白含量。
5．15%SDS-PAGE电泳分析样品纯度
电泳方法同实验九。
（1) 按常规制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶，浓度15％。
（2) 将发酵液上清、解吸液和离子交换洗脱液样品处理后，进行15%SDS-PAGE电泳析。
（3) 电泳2～3h后，取出凝胶，用0.15%考马斯亮兰-R250进行染色。过夜后倾出染液，不断脱色，起初每20min换液1次，1h后每小时换液1次，直到区带明显，画出电泳区
带图谱。 6．结果处理
（1）用箭头图表示重组水蛭素Ⅲ制备的操作流程。 （2）绘制洗脱曲线。
（3）重组水蛭素Ⅲ的纯化过程分析
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重组水蛭素Ⅲ的纯化过程分析
纯化步骤 总蛋白(mg) 总活力(ATU) 比活(ATU/mg) 纯化倍数 收率(%) A.发酵上清液
B.大孔吸附层析 C.DEAE-52 纤维素柱层析
（4) 电泳图谱分析
【思考题】
1．影响重组水蛭素Ⅲ纯度和收率的因素有哪些？如何加以控制？ 2．试说明电泳图谱，并用电泳图谱判断所制得的重组水蛭素Ⅲ的纯度。 3．如何在原核内成功表达小分子多肽类药物而不被宿主内蛋白酶水解？
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实验二十四 酸醇提取法制备猪胰岛素
注：此实验内容来自校企合作课题
【实验目的】
1．学习胰岛素的制备方法
2．了解胰岛素的理化性质及其在制备方面的应用 3．掌握酸醇提取法制备猪胰岛素的技术
【实验原理】
胰岛素（insulin）是动物胰腺中兰氏小岛β-细胞所分泌的一种动物激素，在体内具有降低血液中葡萄糖含量和调节血糖平衡的作用。医疗上主要用于治疗糖尿病， 也是生化工程中作为研究蛋白质结构与功能的常用材料。胰岛素共51个氨基酸，由A、B两条肽链组成。A链含21个氨基酸，B链含30个氨基酸，两条肽链之间借两个二硫键联结，A链的第6与第11位氨基酸之间也有一个二硫键。人胰岛素分子量为5 734Da，等电点为pH5.6。在酸性环境（pH2.5～3.5）较稳定，在碱性溶液中极易失去活力，可形成锌、钴等胰岛素结晶。又由于其分子中酸性氨基酸较多，可与碱性蛋白如鱼精蛋白等结合，形成分子量大、溶解度低的鱼精蛋白锌胰岛素。在显微镜下观察呈正方形或偏斜方形六面体结晶。胰岛素不溶于水和乙醇、乙醚等有机溶剂，但易溶于稀酸和稀碱的水溶液，也能溶于酸性或碱性的稀乙醇和稀丙酮中。
胰岛素一般由动物脏器提取， 其生产方法有酸醇提取减压法、分级提取锌沉淀法和磷酸钙凝胶、DEAE-纤维素及离子交换树脂吸附法。本实验介绍酸醇提取减压浓缩法由猪胰提取胰岛素的方法。
【实验材料】
1．器材：
（1）组织捣碎机 1台
（2）布氏漏斗 10cm 1个 （3）抽滤瓶 1 000ml 1个 （4）抽气泵 1台 （5）剪刀 1把 （6）烧杯 400ml 2个 200ml 2个 100ml 1个
（7）纱布 25cm×25cm 1块 （8）玻璃棒（大） 2根 玻璃棒（小） 2根
（9）量筒 500ml 1只 100ml 1只 10ml 1只
（10）容量瓶 100ml 1只 （11）分液漏斗 250ml 1只 （12）离心机 1台 （13）真空干燥器及真空泵 1套 （14）温度计 100℃量程 1根
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