（15）pH试纸 各种量程规格 1套 2．试剂：
（1）86％乙醇、68％乙醇 （2）草酸
（3）6mol/L硫酸溶液
（4）浓氨水、2mol/L氨水、4mol/L氨水 （5）氯化钠 （6）冷丙酮
（7）20％、6.5％醋酸锌溶液 （8）2％、10％柠檬酸溶液 （9）0.01mol/L 盐酸
（10）0.1mol/L磷酸二氢钠溶液 （11）乙醚 （12）乙腈
【实验方法】
1．操作方法：
(1) 提取：取冻胰块100g用匀浆机绞碎后加入2.3～2.6倍的86％乙醇(w/w)，5％冻胰重的草酸（少许硫酸调至pH2.5～3.0），在10～15℃温度下搅拌提取3h。过滤或离心取上清，滤渣再用l倍量68％乙醇和0.4％冻胰重的草酸及少许硫酸按上法提取2h，同上法分离合并乙醇提取液。
(2) 碱化、酸化：提取液在不断搅拌下加入浓氨水调溶液pH为8.0～8.4（液温10～15℃），立即压滤或离心除去碱性蛋白。澄清液及时加6M硫酸酸化至pH为3.4～3.8，降温至0～5℃，静置4h以上，使酸性蛋白充分沉淀。
(3) 减压浓缩：离心取上清液，在30℃ 以下真空浓缩除去乙醇，浓缩至浓缩液比重为1.04～1.06（约为原来体积的1/9～l/10）为止。
(4) 去脂、盐析： 将浓缩液转入烧杯，于10min内加热至50℃，立即用冰盐水冷却降温至5℃，转置分液漏斗静置3～4h，使油层分离。分出下层清液（上层油脂可用少量蒸馏水洗涤回收胰岛素），调pH为2.3～2.5，于20～25℃在搅拌下加入23％ (W/V)固体氯化钠，搅拌盐析， 静置数小时，盐析物即为粗品胰岛素（含水量约为40%）。
(5) 精制：
① 除酸性蛋白： 取粗制胰岛素，按其干重加入7倍量冰冷蒸馏水溶解 （7倍量水应包括粗制胰岛素中所含水量），再加入3倍量的冷丙酮（按粗品计）并用2mol/L氨水调节pH为4.2～4.3，然后按耗用的2mol/L氨水量补加丙酮使溶液中水和丙酮的比例为7 : 3。充分搅拌后，低温放置过夜，使溶液冷至5℃以下，次日在5℃以下用离心分离法或用布氏漏斗过滤法将沉淀分离。
② 锌沉淀： 在滤液中加入2mol/L氨水调pH到6.2～6.4，按溶液体积加入3.6％醋酸锌溶液（浓度为20％），再用2mol/L氨水调节使最终pH为6.0，低温放置过夜，次日用布氏漏斗过滤，分离沉淀。
③ 结晶： 经丙酮脱水后按每克精品（干重）加入2％柠檬酸50ml、6.5％醋酸锌2ml，丙酮16m1，并用冰水稀释至100ml，置冰浴中速冷至5℃以下，用2M氨水调pH8.0，迅速过滤。滤液立即用10％柠檬酸溶液调pH6.0，然后补加丙酮使整个溶液体系保持丙酮含量为l6%。在10℃下缓慢搅拌2～5h后放入3～5℃冰箱72h使之结晶，前48h内需用玻璃棒间歇搅拌，后24h
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静置不动这一步骤关系到结晶优劣，须仔细操作。在显微镜下观察，外形为正方形或扁斜方形六面体结晶。结晶离心收集，并用毛刷小心刷去晶体上面所覆灰黄色无定形沉淀，用蒸馏水或醋酸铵溶液洗涤，再用丙酮、乙醚脱水，离心后，在五氧化二磷真空干燥箱中干燥，即得结晶胰岛素，效价每毫克应在25单位以上。
(6) 检测：取对照品及供试品适量，分别加0.01mol/L 盐酸溶液制1ml中含40单位的溶液，照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(5μm)；柱温40℃；以0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（用磷酸调节pH值为3.0）-乙腈(73:27)或适宜比例的混合液（含0.1mol/L硫酸钠）为流动相；检测波长为214nm；流速为1ml/min。取供试品溶液及对照品溶液各20μl 注入液相色谱仪，记录主峰的保留时间，供试品的主峰保留时间应与同种属对照品的主峰保留时间一致。
(7) 效价测定：将效价确定的Insulin标准品用0.01mol/L盐酸液配制并稀释成40、30、20、10、1和0.5U/ml溶液。样品原料以0.01mol/L盐酸液配制并稀释成1.5mol/ml溶液进样测定。效价计算以主峰面积为纵坐标，Insulin浓度为横坐标进行线性回归，计算而得。
【思考题】
1．提取过程中，影响胰岛素活性/效价的因素有哪些？如何提高提取率？ 2．制备猪胰岛素的原理及其应注意的问题
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实验二十五 多肽缩宫素的Fmoc固相合成法
注：此实验内容来自校企合作课题
【实验目的】
1．学习多肽固相合成的方法及其分离纯化操作。
2．了解多肽固相合成的基本原理以及合成中功能基团的侧链保护策略。 3．掌握缩宫素Fmoc固相合成法的基本原理及其注意事项。
【实验原理】
1963年Merrifield创建并发展了多肽固相合成（solid-phase polypeptide synthesis）方法之后，多肽研究领域发生了划时代的变化。固相方法以快速简便的操作和高产率显示了无可比拟的优越性，应用该方法几乎可以随心所欲地合成任何多肽。
缩宫素(oxytocin)是垂体后叶激素的主要成分之一，临床主要用于引产、产时子宫收缩乏力、产后出血、子宫复位不良及月经过多等，是由8种氨基酸按如下所示的顺序排列，通过肽键结合而成的9肽化合物。
S S
(C端)-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-(N端)
Fmoc固相合成法制备缩宫素的原理是：
首先将其所含的8种氨基酸分别制成Nα-芴甲氧羰基( Fmoc)氨基酸，然后从C端开始，将氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性高分子树脂相连，就以这一氨基酸的氨基作为合成的起点，使其同排列顺序中相邻的氨基酸的羧基发生酰化反应，形成酰胺键（肽键），然后再让这一包括两个氨基酸的树脂肽的氨基与下一个氨基酸上的羧基形成肽键，并不断重复这一过程，即可逐渐延长肽键，直至缩宫素的N端形成为止。
用固相方法合成具有特定氨基酸顺序的多肽必须满足3个条件：一是通常把要合成多肽的羧基端键合到固相载体上，然后从氨基端逐步增长肽链；二是需要对暂不参与形成酰胺键的氨基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基团也要保护，反应完成后再将保护基团除去；三是对参与形成酰胺键的羧基必须进行活化。
【实验材料】
1．器材
（1）多肽合成反应器 1台 （2）旋转蒸发仪 1台 （3）高速冷冻离心机 1台 （4）HPLC 1台 （5）真空泵 1台 （6）电子天平 1台 （7）电动搅拌机 1台 （8）电热恒温干燥箱 1台 （9）圆底烧瓶 50ml 1个 (10) 量筒 10ml 1个 100ml 1个 (11) 布氏漏斗 1个 2．试剂
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（1）Fmoc保护氨基酸: Fmoc-Cys(Trt)-OH； Fmoc-Tyr(tBu)-OH；
Fmoc-Asn(Trt)-OH； Fmoc-Gln(Trt)-OH； Fmoc-Ile-OH； Fmoc-Pro-OH； Fmoc-Leu-OH；
注：Fmoc–氨基酸(Trt)-OH表示氨基酸的α-氨基和侧链基团已分别被Fmoc和Trt（三苯甲基）所保护。 （2）HOBt
（3）DIC（二异丙基碳二亚胺） （4）TFA（trifluoroacetic aci） （5）DMSO
（6）哌啶经重蒸后使用
（7）DMF（二甲基甲酰胺） （8）茚三酮
（9）Cys(Trt)-2-Chlorotrityl Resin （半胱氨酸-2-氯三苯甲基树脂）
【实验方法】
1．粗品制备
(1) 称取约含0.2mmol半胱氨酸的半胱氨酸-2-氯三苯甲基树脂，用10ml DMF溶胀30min，抽滤。
活化Fmoc-氨基酸：向0.3mmol Fmoc-Tyr(tBu)-OH中加入10ml溶有0.33mmol DIC和0.45mmol HOBt的DMF溶液，摇匀静置活化20min。
(2) 缩合：将活化好的Fmoc-氨基酸溶液加到盛有上述树脂的反应器皿中，室温下缓慢摇动反应2h，抽滤，用DMF洗3次，每次5ml。
(3) 脱除Fmoc保护： 将10ml含20%哌啶的DMF溶液加到盛有上述树脂的反应器中室温下反应30min除去Fmoc保护基团，抽滤，然后用5ml DMF洗涤3次。采用同样的试剂用量和操作步骤，按缩宫素分子序列顺序依次用下一种保护型氨基酸重复上面的接肽反应，直到最终形成所需的多肽序列。
(4) 侧链脱保护及多肽链脱离树脂：向肽-树脂样品中按15ml/g树脂的比例加入K试剂[三氟乙酸/二氯甲烷/1，2-乙二硫醇/苯甲醚/水(80/10/5/3/2，v/v)]，室温下摇动反应4h。抽滤后用1ml~2ml TFA分两次洗涤树脂，洗涤液并入裂解液中。将裂解液旋转蒸发浓缩至小体积，然后将裂解液滴入100ml冷乙醚中得到多肽沉淀，将沉淀冷冻离心分离。 (5) 成键反应：将上述沉淀溶解于10ml 25％的DMSO水溶液中，摇匀并在室温下静置24h形成二硫键，然后将溶液冻干得到粗品氧化产物。 2．精制
缩宫素粗品产物通过Sephadex G-15凝胶过滤层析，用25%的醋酸水溶液洗脱进行纯化。洗脱产物采用制备型高效液相，经反相键合C18柱进行梯度洗脱最终纯化。
色谱条件为：流动相由含0.1%TFA的10%-75%的乙腈溶液在35min内进行梯度洗脱，流速为1.5ml/min，检测波长为220nm。
3． 检测
粗品作为供试品溶液进行薄层层析检测，应只有一个清晰的斑点，薄层板采用G60-F254型硅胶板，溶剂展开系统取丁醇:醋酸:水=4:1:5的混合液的上清，或乙腈:水=5:1的混合溶剂。 取本品作为供试品溶液，另取合成缩宫素对照品，加0.9%氯化钠溶液制成每1ml中含5个单位或10个单位的对照品溶液。照高效液相色谱法，以辛基硅烷键合硅胶为填充剂，0.1mol/L磷酸二氢钠溶液-乙腈(82:18)为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长为220nm。取供试品溶液与相同浓度的对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，供试品与对照品主峰的保留
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时间应一致。
4．效价测定（大白鼠离体子宫法）
本法系比较垂体后叶或合成缩宫素标准品(S)与供试品(T)引起离体大鼠子宫收缩的作用，以测定供试品的效价。 (1) 溶液的配制： ① 标准品溶液的配制：
迅速精密称取垂体后叶标准品适量，注意避免吸潮，先加少量0.25％醋酸溶液，仔细研磨，移至硬质大试管中，再精密加0.25％醋酸溶液使成每1ml中含缩宫素1单位的溶
液。管口轻放一玻璃塞，浸入沸腾的水中，持续振摇，加热煮沸5min取出，迅速冷却，
滤过，滤液分装于适宜的容器内，4～8℃贮存，如无沉淀析出，可在3个月内使用。 ② 标准品稀释液的配制：
实验当日，精密量取垂体后叶标准品溶液适量或取合成缩宫素标准品，按标示效价加入0.9%氯化钠溶液配成每1ml中含缩宫素1单位的溶液，按高低剂量组(ds<[2]>，ds<[1]>)加0.9％氯化钠溶液配成两种浓度的稀释液，一般高浓度稀释液可配成每1ml中含0.01～0.02单位，高低剂量的比值(r)一般不得大于1:0.7。调节剂量使低剂量能引起子宫收缩，一般在20～50mm；高剂量应不致使子宫收缩达到极限，一般为50～85mm，且高低剂量所致子宫的收缩应有明显差别。
③ 供试品溶液与稀释液的配制：
按供试品的标示量或估计效价(A<[T]>)，照标准品溶液与其稀释液的配制法配成，高低两种浓度的稀释液，其比值(r)应与标准品相等，供试品和标准品高低剂量所致的反应均值应相近。
④ 子宫肌蓄养液的配制：
试验当日，取氯化钠9g、氯化钾0.42g、氯化钙（按无水物计算）0.06g与葡萄糖0.5g，加水700ml使溶解，另取碳酸氢钠0.5g，加水约200ml溶解后，缓缓倾注于前一溶液中，边加边搅拌，最后补加蒸馏水至1 000ml。 (2) 供试用动物：
取健康合格的成年雌性大鼠，断乳后即与雄鼠隔离，出生后不超过 3个月，体重160～240g。试验当日，选择阴道涂片在动情前期的动物，也可用雌性激素处理使子宫涂片为动情前期或动情期的动物。
(3) 检定法：
取选定的大鼠迅速处死，剖腹取出子宫，仔细分离附在子宫肌上的结缔组织，注意避免因牵拉使子宫肌受损。在子宫分叉处剪下左右2条，取一条将其下端固定于离体器官恒温水浴装置的浴杯底部，上端用线与记录装置相连，以描记子宫收缩；浴杯中加入一定量的子宫肌蓄养液(约30～50ml)，连续通入适量空气。蓄养液应调节至32～35℃之间并保持恒温(±0.5℃)，子宫放入浴杯后，静置约15min，按次序准确注入等体积的标准品或供试品两种浓度的稀释液(0.3～0.8ml)，待子宫肌收缩至最高点开始松驰时（约60～90s），放去蓄养液并用蓄养液洗涤一次，再加入等量蓄养液，静置；相邻两次给药的间隔时间应相等（约3～5min)，每次给药应在前一次反应恢复稳定以后进行。标准品稀释液和供试品稀释液各取高低两个剂量(ds<[2]>、ds<[1]>、d<[T]><[2]>、d<[T]><[1]>)为一组，按随机区组设计的次序轮流注入每组4个剂量，重复4～6组。
测量各剂量所致子宫收缩的高度，照生物检定统计法（附录ⅩⅣ）中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差。本法的可信限率FL(％)不得大于10％。
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