【思考题】
1．肽缩合反应中干扰最终产物分离纯化的原因是什么？解决上述问题可以从哪三方面来考虑？
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第三节 核酸类药物
实验二十六 酵母RNA的制备和单核苷酸的离子交换柱层析分析
注：此实验内容来自校企合作课题
【实验目的】
1．学习以酵母为原料采用稀碱法制备RNA的原理和方法 2．掌握离子交换法分离单核苷酸的原理和方法
【实验原理】
从微生物中提取RNA 是工业上最实际有效的方法。一些最常见的菌体，如啤酒酵母、纸浆酵母、石油酵母、面包酵母、百地霉等均含有丰富的核酸资源。工业上制备RNA一般选用成本较低，适于大规模操作的稀碱法和浓盐法。稀碱法是用氢氧化钠溶液，使细胞壁变性裂解，浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。如用稀碱法，需用酸中和。然后除去菌体碎片，将pH调至RNA的等电点（pH 2.5），使RNA沉淀下来，该法的缺点是制备的RNA分子量较低。
核酸经酸、碱或酶水解可以产生各种核苷酸，核苷酸的可解离基团是第一磷酸基、含氮环上的-NH2 和第二个磷酸基等，它们的解离常数（pK）和由此得到的等电点差异是进行离子交换层析分离的基础。四种单核苷酸的解离常数和等电点见表1。
表1 四种单核苷酸的解离常数（pKa）和等电点（pI）
核苷酸 腺苷酸（AMP） 鸟苷酸（GMP） 胞苷酸（CMP） 尿苷酸（UMP）
第一磷酸基（pKa1）
0.9 0.7 0.8 1.0
含氮环(pKa2)
3.7 2.4 4.5 —
第二磷酸基(pKa3)
6.2 6.1 6.3 6.4
等电点(pI) 2.35 1.55 2.65 —
在一定条件下，离子交换树脂对不同单核苷酸的吸附能力是不同的，因此选择适当类型
的离子交换树脂，控制吸附及洗脱的条件便可分离各种单核苷酸。为了增加单核苷酸在离子交换树脂上的吸附能力，需要控制条件使单核苷酸带上大量相应电荷，这主要是通过调节pH值，使单核苷酸的一些可解离基团（磷酸基、氨基、烯醇基）解离，同时应减少上柱溶液中除单核苷酸外的其它离子强度。而洗脱时则相反，应使被吸附的单核苷酸的相应电荷降低，通常是增加洗脱液中竞争性的离子强度，必要时提高温度使离子交换树脂对单核苷酸的非极性吸附作用减弱。
RNA可被碱水解成2’-或3’-核苷酸。可利用阳离子交换树脂（聚苯乙烯-二乙烯苯，磺酸型）或阳离子交换树脂（聚苯乙烯-二乙烯苯、季铵碱型）分离核苷酸。本实验利用强碱型阳离子交换树脂（强碱型201×8、强碱型201×7、国产717、Dowexl、Amberite IRA-400或Zerolit FF）将各类核苷酸分开，测定核苷酸的紫外吸收光谱的比值：O.D250/O.D260、O.D280/O.260、O.D290/O.D280对照标准比值表（表2），可以确定其为何种核苷酸。
【实验材料】
1．试剂：
（1）氢氧化钠（工业级）；
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（2）盐酸； （3）95%乙醇；
（4）1mol/L甲酸：取21.4 ml 88%甲酸定容至500 ml；
（5）1mol/L甲酸钠溶液：称32.15g甲酸钠用水溶液定容至500 ml； （6）0.02mol/L甲酸：取10 ml 1mol/L甲酸定容至500ml； （7）0.15 mol/L甲酸：取75 ml 1mol/L甲酸定容至500ml；
（8）0.01 mol/L甲酸-0.05mol/L甲酸钠溶液（pH 4.44）：取5ml 1mol/L 甲酸，25ml 1mol/L
甲酸钠溶液定容500ml；
（9） 0.01 mol/L甲酸-0.1 mol/L甲酸钠溶液（pH 3.74）：取50 ml 1 mol/L甲酸，50 ml 1
mol/L甲酸钠溶液定容至500 ml；
（10）0.3mol/L氢氧化钾溶液：取1.68g氢氧化钾用水溶液定容至100 ml； （11）2 mol/L过氯酸：取17 ml 70~72%过氯酸定容至100 ml； （12）1 mol/L盐酸；
（13）0.5mol/L氢氧化钠溶液； （14）新鲜啤酒酵母； 2．器材：
（1）烘箱 1台 （2）电动搅拌器 1台 （3）桶或缸 1个 （4）离心机 1台 （5）滤布 若干 （6）玻璃层析柱 1.1cm×20cm 1根 （7）部分收集器 1台 （8）紫外分光光度计 1台 （9）恒温水浴 1台
【实验方法】
1． RNA的制备
取啤酒酵母于2~3℃条件下每天用水洗一次，共洗3 ~ 4次，最后沉淀1 ~2d。倾去上清液，得酵母泥。取酵母泥10g，置培养皿内，于105℃烘箱内烤干，测定其含水量。这样的酵母泥一般含干酵母15%左右。
加水将酵母泥调成5~10%干重的菌悬液，再加入浓的氢氧化钠溶液，使氢氧化钠的最终浓度（即提取时的浓度）为1%。在20℃条件下电动搅拌30~45min（如室温在20℃以下，可以适当延长时间）。然后用6 mol/L盐酸中和至pH 7.0，再搅拌10 min，直火或用蒸汽迅速加热到90℃在该温度下保持10min，迅速下降到10℃以下，与低温处静置3～6d，沉出蛋白质和酵母残渣。虹吸取出上清液。向下层混浊液中加入1/3体积的水，搅匀，静置过夜。于3 000r/min离心20 min左右，取出上清液。将上述二次上清液（含RNA）合并。
用6 mol/L盐酸调至pH 2.5（RNA的等电点），低温放置过夜。离心收集RNA沉淀，用少量乙醇洗二次，干燥。所得的RNA制品，色微黄，产率为4～5% ，RNA含量可达60～70% 。
2．单核苷酸的分离 （1）样品处理
取20 mg上述RNA制品，溶于2ml 0.3 mol/L氢氧化钾溶液中，于37℃水解20h，RNA
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在碱作用下水解成单核苷酸，水解完成后，用2mol/L过氯酸溶液调至pH 2.0以下，以4 000r/min离心10min，取上清液，用2 mol/L氢氧化钠溶液调至pH 8.0，并用紫外分光光度计准确测得含量后待用。
（2）离子交换柱的安装
取内径1.1～1.2cm 的层析柱，将处理好的强碱型阴离子交换树脂悬浮液一次倒入玻璃柱内，使树脂自由沉降至柱下部，用一小片圆滤纸盖在树脂面上。缓慢放出液体，使液面降至滤纸片下树脂面上。（注意在整个操作过程中防止液面低于树脂，当液面低于树脂表面时空气将进入，在树脂内形成气泡，妨碍层析结果）。经沉积后离子交换树脂柱床高7～8 cm。 （3）加样
将RNA水解液小心地用滴管加到离子交换树脂柱上，待样品液面降低到滤纸片内时，用50ml蒸馏水淋洗树脂柱。碱基、核苷及其它不被阴离子交换树脂吸附的杂质均被洗出。 （4）核苷酸混合物的洗脱
收集蒸馏水洗脱液，在紫外分光光度计上测260nm处光密度，待洗脱液不含紫外吸收物质（光密度值低于0.02）时，可用甲酸及甲酸钠溶液进行洗脱。
依次用下列洗脱液分段洗脱，500ml 0.02mol/L甲酸；500ml 0.15mol/L甲酸；500ml 0.1mol/L甲酸-0.05mol/L甲酸钠溶液（pH4.44）；最后用500ml 0.1mol/L甲酸-0.1mol/L甲酸钠溶液（pH3.74）。用部分收集器收集流出液，控制流速8ml/10min，8ml/管。
（5）由层析柱所得各部分洗脱液的分析
以相应浓度的甲酸或甲酸钠溶液作为空白对照，用紫外分光光度计测各管溶液在260 nm 波长处光密度值，以洗脱液体积（或管数）为横坐标，光密度值为纵坐标作图，分析各部分波峰位置。
根据各部分核苷酸在不同波长时光密度的比值（O.D250/O.D260、O.D280/O.260、O.D290/O.D280），对照标准比值（见表2）以及洗脱时的相应位置确定其为何种核苷酸。由洗脱液的体积和它们在紫外部分的光密度值，计算各种核苷酸的含量。
附：强碱型阴离子交换树脂201×8（聚丙乙烯-二乙烯苯，三甲胺季铵碱型，全交换量大于3毫克当量/克干树脂，100~200目）的处理方法：用水浸泡并利用浮选法除去细小颗粒，使用时先用0.5mol/L氢氧化钠溶液浸泡1h，以除去碱性溶液杂质然后用无离子水洗至中性。再用1mol/L盐酸浸泡0.5h，除去酸溶性杂质，再用无离子水洗至中性。然后用1mol/L甲酸钠溶液浸泡，使树脂转变成甲酸型。将树脂装入柱内，继续用1mol/L甲酸钠溶液洗，直至流出液中不含氯离子（用1%硝酸银溶液检查）。最后用1mol/L甲酸洗，直至260 nm处光密度值低于0.02，并用蒸馏水洗至接近中性，即可使用。
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表2 部分核苷酸的物理常数
核苷酸
分子量
pH 异 构 体
AMP
紫外吸收广谱性质
克分子消光系数
光密度比值
ε260×10 2 14.5 14.5 14.5 12.3 12.3 11.6 6.9 6.9 6.3 9.9 9.9 9.9
7 15.5 15.3 15.3 12.0 12.0 11.7 7.75 7.6 7.4 9.9 9.9 9.9
-3
250／260 2 0.85 0.85 0.85 0.90 0.90 1.22 0.48 0.46 0.46 0.79 0.74 0.74
7 0.8 0.8 0.8 1.15 1.15 1.15 0.86 0.84 0,84 0.85 0.83 0.73
280／260 2 0.23 0.23 0.22 0.68 0.68 0.68 1.83 2.00 2.10 0.30 0.33 0.38
7 0.15 0.15 0.15 0.68 0.68 0.68 0.86 0.93 0.99 0.25 0.25 0.40
290／260 2
7
347.2 363.2
2’ 3’ 5’ 2’ 3’ 5’ 2’ 3’ 5’
0.038 0.009 0.038 0.009 0.03 0.009 0.48 0.48 0.40 1.22 1.45 1.55 0.03 0.03 0.03
0.285 0.285 0.28 0.26 0.30 0.30 0.02 0.02 0.03
GMP
CMP
323.2
UMP
324.2 2’ 3’ 5’
【思考题】
1. 离子交换法分离单核苷酸的原理？
2. 离子交换时常用的洗脱方式有哪些？各有何特点？
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