重组L-门冬酰胺酶Ⅱ制备和酶活力测定： （1) 培养基：
种子培养基（LB 液体培养基）；
发酵培养基（玉米浆培养基）：玉米浆50g/L，牛肉浸膏35g/L，味精10g/L， pH7.0，高压灭菌。接种前在无菌条件下加入抗生素氨苄青霉素。 （2) 氨苄青霉素(Amp)；
（3) 破壁液：45%蔗糖，10 mmol/L EDTA，200mg/L溶菌酶，pH 7.5；
（4) 奈氏试剂：称碘化钾5g加入5ml蒸馏水中，边搅拌边滴加25％氯化汞饱和液至稍有红色沉淀出现。再加40ml 50％氢氧化钠溶液，最后用蒸馏水稀释至100ml，混匀入棕色试剂瓶中置暗处保存；
（5) 1 mol/L氯化锰（MnCl2）； （6) 5 mol/L 磷酸缓冲液(pH6.4)；
（7) pH8.4硼酸缓冲液：0.858g硼砂(MW=381.37)， 0.680g硼酸(MW=61.83)，用蒸馏水稀释至100 ml； （8) 溶菌酶； （9) 蔗糖； （10) 氯化钠；
（11) 三（羟甲基）胺基甲烷（Tris）； （12) 乙醇； （13) 氢氧化钠； （14) 硫酸铵；
（15) 谷氨酸钠（或含99%谷氨酸钠的味精）； （16) 四甲基乙二胺（EDTA）； （17) 盐酸；
（18) 玉米浆；
（19) 低分子量标准蛋白(14. 4 ～94 K Da)； 12%SDS-PAGE电泳分析： 同实验九。
【实验方法】
1．工程菌发酵培养
（1）从平板上挑取菌种接种于新鲜的含氨苄青霉素(终浓度为100 μg/ml )的LB液体培养基中，37℃，摇床转速220 r/min，培养至OD600为0.48～0.6h。
（2）摇瓶培养：再按2%接种量转接于发酵培养基(三角瓶20%装液量)中，37℃，250r/min，20h，12 000r/min离心收集细胞。
（3） 批式发酵培养：20L的发酵罐装入14L发酵培养基, 初始pH值为7.0，121℃下灭菌20 min，待温度降至37℃时加氨苄青霉素至最终浓度为100μg/ml ，接入种子液700ml，37℃培养12～14h， 罐压力0.05Mpa。 2．重组L-门冬酰胺酶Ⅱ分离纯化制备
（1）蔗糖溶液渗透振扰法和酶解法联用提取酶
将发酵收获的菌体细胞悬浮于5倍体积的破壁液中，在30℃温和振荡70 min后搅拌下倾入大量水中，4 ℃，边搅拌边加入1 mol/L MnCl2 (7.5%，V/V) ，沉淀核酸和菌体碎片， 8 000r/min，离心30min，收集上清液即得酶提取液。采用Lowry法和Peterson修订法分
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别检测目的蛋白重组L-门冬酰胺酶Ⅱ含量和酶活性及进行12%SDS-PAGE电泳分析。计算收率。
（2）硫酸铵分级沉淀
在酶提取液中加入硫酸铵至55%饱和度，调pH到7.0，冰水浴磁力搅拌60 min，4 ℃静置过夜，12 000r/min离心10min除去沉淀。再在上清液中加入硫酸铵至90%饱和度，调pH至等电点附近（约pH5.0）， 搅拌60 min，4 ℃静置过夜，12 000r/min离心10min，收集沉淀。采用Lowry法和Peterson修订法分别检测目的蛋白重组L-门冬酰胺酶Ⅱ含量和酶活性及进行12%SDS-PAGE电泳分析。计算收率。
（3）透析脱盐
上述沉淀物用5 mol/L 磷酸缓冲液(pH6.4)溶解，透析脱盐。 （4) DEAE-52阴离子交换柱层析
DEAE-纤维素柱经5 mmol/L磷酸缓冲液 (pH6.4)平衡后，上样品脱盐酶液，用相同缓冲液洗涤至基线平稳，改用50 mmol/L磷酸缓冲液(pH6.4)洗脱，分部收集器收集，1.5ml/min,每管收集6ml，测定每管的A280值和酶活性。绘制洗脱曲线。收集显示酶活性组分，冷冻干燥后即得高纯度的L-门冬酰胺酶冻干粉。采用Lowry法和Peterson修订法分别检测目的蛋白重组L-门冬酰胺酶Ⅱ含量和酶活性及进行12%SDS-PAGE电泳分析。计算收率。
3．重组L-门冬酰胺酶Ⅱ酶活性测定
吸取1ml菌液入Ep管，12 000 r/min离心5min，收集菌体弃去上清，加入蒸馏水1ml洗涤，混悬，12 000r/min离心5min，弃上清。重复上述操作2～3次，加入pH8.4硼酸缓冲液1ml混悬。
准备一组(2支)蒸馏水准备管：取10ml的洁净试管2只，每管加3.5ml蒸馏水。 另取2支10ml的洁净试管，分别加入0.04 mol/L天冬酰胺底物，0.1 mol/L pH8.4硼酸缓冲液各1ml，37℃水浴5min，其中一只加入细胞悬液20μl，另一支为对照管。反应15min后分别加入50%三氯乙酸1ml终止反应。再从终止反应管中各支取500μl进蒸馏水准备管，每管分别加入与25%NaOH以1:1配好的奈氏液1ml显色，500nm处测OD值。
计算： 酶活力(U)=[(OD×1000)/(0.07×15x)]×(3+x/1000)
x为取样体积(本实验为20μl)
4．比活力测定方法
精确称取纯化产物10mg，溶解于1 mlH2O中，采用Lowry法测定蛋白质含量，并测定酶活力，经以下公式换算即得单位质量的rL-ASPⅡ比活力。rL-ASPⅡ比活力=酶活力(U)/蛋白含量。
5．12%SDS-PAGE电泳分析样品纯度
电泳方法同实验九。
（1) 按常规制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶，浓度12％。
（2) 将发酵收获的细胞、酶提取液、硫酸铵分级沉淀和离子交换洗脱液样品处理后，进行电泳分析。
（3) 电泳2～3h后，取出凝胶，用0.15%考马斯亮蓝-R250进行染色。过夜后倾出染液，不断脱色，起初每20min换液1次，1h后每小时换液1次，直到区带明显，画出电泳区带图谱。 6．结果处理
（1）用箭头图表示重组L-门冬酰胺酶Ⅱ制备的操作流程。 （2）绘制洗脱曲线。
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（3）重组L-门冬酰胺酶Ⅱ的纯化过程分析
重组L-门冬酰胺酶Ⅱ的纯化过程分析
纯化步骤 总蛋白(mg) 总活力(U) 比活(U/mg) 纯化倍数 收率(%) A.粗提酶液
B.硫酸铵沉淀 C.DEAE-52 纤维素柱层析
（4) 电泳图谱分析
【思考题】
1．试说明电泳图谱，并用电泳图谱判断所制得的重组L-门冬酰胺酶Ⅱ的纯度。 2．影响重组L-门冬酰胺酶Ⅱ纯度和收率的因素有哪些？如何加以控制？ 3．硫酸铵分级沉淀的机理？
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