实验二十七 单核苷酸衍生物制备
注：此实验内容来自校企合作课题，部分成果已申请专利
【实验目的】
1．学习单核苷酸衍生物的生物制备方法。 2．了解单核苷酸衍生物制备的原理和一般方法。
【实验原理】
核苷类药物传统的制造方法一般采用化学合成,此方法缺点是步骤多、难度高、周期长且有异构体产生。例如要对天然核苷进行化学修饰，往往需要先对碱基或核糖基团进行保护，此后还要去除保护基团，这样合成反应总收率将会降低。用化学法将碱基与核糖缩合，还可能形成α-异构体,影响产率。
酶法合成的优点在于可合成复杂的生物分子，与特定基团选择性结合，无需基团的保护，酶反应效率高，其底物可以是天然底物的类似物。酶法合成核苷类药物的原理是：利用微生物中产生的核苷磷酸化酶催化核苷、碱基转换反应，即由廉价供应的天然核苷为原料将其核糖基进行化学修饰后作为核糖基供体，利用核苷磷酸化酶或脱氧核糖转移酶为酶源，天然或杂环碱基为核糖基受体酶法合成核苷及其类似物，反应式如下：
当核苷1为尿苷、碱基1为5-氟尿嘧啶时即可转化合成5-氟尿苷。
【实验材料】
1．器材
（1）高效液相色谱仪 Agilent 1100 1台
（2）摇床； 1台 （3）紫外可见分光光度计 1台 （4）台式水浴恒温振荡器 1台 （5）高压灭菌锅 1台 （6）台式高速离心机 1台 （7）电子分析天平 1台 （8）取液器 1 000μl、 200μl 各1支 2．试剂
（1）牛肉浸膏 （2）酵母浸出汁 （3）蛋白胨 （4）硼砂 （5）乙二醇 （6）甘氨酸 （7）环己胺 （8）EDTA
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（9）尿苷 （10）尿嘧啶 （11）5-氟尿嘧啶
【实验方法】
1．菌体培养
经斜面活化的产气肠杆菌EMA-Z1先接种2环于摇瓶培养种子，在31℃、200r/min摇床中培养6~7h，以10％的接种量接种于摇瓶，于31oC、200r/min摇床培养13h。 2．菌体的制备
培养液于3 600r/min离心24min，所得菌体用10mmol/L的磷酸钠盐缓冲液（pH7.0）重悬，于12 000r/min离心5min，去除上清，用上述缓冲液重悬再以同样条件离心5min，洗去残余的培养基，去除上层黑色物质，所得湿菌体于4C冰箱保存备用。
3．微生物转化
10mmol/L尿苷（UR）、30mmol/L5-氟尿嘧啶（FU）、30mmol/L磷酸钠盐盐缓冲液(NaOH调pH7.8)和含10g/100ml产气肠杆菌湿菌体的酶反应混合物于恒温水浴振荡器中55oC、150r/min振荡反应9h后加入0.5倍体积的3mmol/L的HCl终止反应，12 000r/min离心5min，取上清液，HPLC分析产物浓度。
4．检测方法
Waters 1525高效液相色谱仪，Lichrospher C18 柱4.6 mm×250mm，260nm检测。 流动相：磷酸二氢钠:甲醇（90:10）；流速：1ml/min；进样量：10μl。
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【思考题】
1．单核苷酸衍生物的生物制备方法有何特点? 2．实验中菌体的培养时间对转化反应有什么影响?
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第四节 酶类药物
实验二十八 胰弹性蛋白酶的制备及活力测定
注：此实验来自项目超氧化物歧化酶的分离纯化（省课题）的成果
【实验目的】
1．学习弹性蛋白酶制备的方法。 2．掌握弹性蛋白酶活性测定的原理。
【实验原理】
弹性蛋白酶（Elastase E C3.4.4.7），又称胰肽酶E，是一种肽链内切酶，根据它水解弹性蛋白的专一性又称为弹性水解酶。弹性酶为白色针状结晶，是由240个氨基酸残基组成的单一肽链，分子量为25 900，等电点为9.5。其最适pH随缓冲体系而略异，通常为pH 7.4～10.3，在0.1mol/L碳酸缓冲液中为8.8。光吸收系数ε lcm 280 nm＝5.74×104，E1cm1(0 nm＝22.2（0.1mol/L氢氧化钠）；ε lcm 280 nm＝5.23×104，E1cm1(0nm＝20.2（0.05mol/L pH 8.0乙酸钠）。
结晶弹性酶难溶于水，电泳纯的弹性酶易溶于水和稀盐酸溶液（可达50 mg／ml），在pH 4.5以下溶解度较小，增加pH可以增加溶解度。弹性酶在pH 4.0～10.5，于20℃较稳定，pH＜6．0稳定性有所增加，冻干粉于5℃可保存6～12个月。在-10℃保存更为稳定。
弹性蛋白唯有弹性酶才能水解。弹性酶除能水解弹性蛋白外还可水解血红蛋白、血纤维蛋白等。许多抑制剂能使弹性酶活力降低或消失，如10mol/L硫酸铜，7×10mol/L氯化钠可抑制50％酶活力，氰化钠、硫酸铵、氯化钾、三氯化磷也有类似作用。上述抑制作用一般多为可逆。另外大豆胰蛋白酶抑制剂、血清或肠内非透析物等也有抑制作用。其它如硫代苹果酸、巯基琥珀酸、二异丙基氟代磷酸等均能强力抑制酶活力。
弹性酶广泛存在于哺乳动物胰脏，弹性酶原合成于胰脏的腺泡组织（Micin），经胰蛋白酶或肠激酶激活后才成为活性酶。本实验以新鲜猪胰脏为原料进行提取，然后再用离子交换层析法进行纯化，得到弹性酶。所得产品以刚果红弹性蛋白为底物采用比色法测其活力，。
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【实验材料】
1． 器材：
(1) 组织捣碎机 1台
(2) 电动搅拌器 1台 (3) 布氏漏斗 10cm 1只 (4) 吸滤瓶 1 000ml 1只 (5) 抽气泵 1台 (6) 剪刀 1把 (7) 烧杯 800ml 1只 (8) 烧杯 400ml 1只 (9) 绸布 25cm×25cm 1块
(10) 量筒 500ml 1只
100ml 1只
(11) 玻璃棒（大） 2根 (12) 玻璃棒（小） 6根 (13) 试管 10 ml 18支
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(14) 吸量管 5ml 18支
1ml 2支
(15) 721型分光光度计 1台 (16) 乳钵 10 cm l只 (17) 真空干燥器及真空泵 1套
2．试剂：
(1) 0.1mol/L pH 4.5醋酸缓冲液：NaAc·3H2O 5.85克与36％醋酸溶液9.51ml（冰醋酸3.42ml）溶于水，稀释至1 000ml，pH计校正。
(2) 1.0mol/L pH 9.3氯化铵缓冲液：26.8克氯化铵溶于500ml水中，用浓氯水调整至pH 9.3。
(3) pH 8.8 硼酸缓冲液：取3.72克硼酸和13.43克硼砂溶于水中，稀释至1 000ml，pH计校正。
(4) pH 6.0 磷酸缓冲液：取KH2PO4 6.071克，NaOH 0.215克溶于1 000ml水，pH计校正。
(5) 2mol/L醋酸。 (6) 丙酮。
(7) 刚果红弹性蛋白。 (8) 弹性酶纯品。
(9) Amberlite CG50树脂。
【实验方法】
1．预处理及细胞破碎
取冻胰脏，剪去脂肪，切成小块。称取100g加入50ml醋酸缓冲液（内含0.05 mol/L CaC12），用组织捣碎机搅碎，静置活化。
2．提取
再加入200ml pH 4.5 0.1mol/L醋酸缓冲液，25℃搅拌（机械搅拌）提取1.5h。离心（3 000r/min，15min）除去上层油脂及沉淀。用绸布挤滤，保留滤液。 3．树脂吸附
滤液中加100ml蒸馏水及40g（抽干重）经过处理的Amberlite CG50树脂，于20～25℃搅拌吸附2.5h。倾去上层液体，树脂用蒸馏水洗涤。重复洗涤5～6次。 4．解析
树脂中加50ml l mol/L pH 9.3 NH4C1液，搅拌洗脱lh。洗脱过程中每隔10min测一次pH，整个过程须保证5.2＜pH＜6.0，否则用氨水调节。经布氏漏斗滤过的洗脱液调节至pH7.0，置冰箱或冰盐浴预冷15min。 5．成品收集
在-5℃条件下边搅拌边加入3倍体积冷丙酮，继续搅2min。低温静置20min。离心 （3 000 r/min，15min）收集沉淀，将沉淀移入离心试管中，用10倍量冷丙酮分两次洗涤离心，再用5倍量乙醚洗一次，离心。置真空干燥器内用P2O5干燥得弹性酶粉，称重。 6．活力测定
活力单位定义：在pH 8.8，37℃条件下作用20min，水解1.0mg刚果红弹性蛋白的酶量定义为一个活力单位。
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(1) 标准曲线的制作：取6支试管按下表操作：
管号
刚果红弹性蛋白（mg）
弹性酶液（ml） PH 8.8硼酸缓冲液（ml）
1 5 5 —
2 10 5 —
3 15 5 —
4 20 5 —
5 25 5 —
0 10 0 5
37℃水解60min（间歇搅拌30次）
PH 6.6磷酸缓冲液（ml）
5
5
5
5
5
5
3 000r/min×10min 离心后取上清
A(495nm)
注意：（1）刚果红弹性蛋白称量须准确。
（2）标准液中酶量是过量的，以保证水解完全。
(2)样品测定
精确称取样品5 mg左右（如效价高可适当减少）置乳钵中，加5ml（先加少量）pH 8.8硼酸缓冲液研磨至完全溶解。吸取lml于大试管中，用上述缓冲液配制约每毫升5～10单位的待测液，取3支试管接下表操作：
管号
刚果红弹性蛋白（mg） PH 8.8硼酸缓冲液（ml）
待测酶液（ml）
1 6 4 1
2 6 4 1
0 3 5 0
37℃水解20min（间歇搅拌20次以上）
磷酸缓冲液（ml）
5
5
5
3 000r/min×10min 离心后取上清
A(495nm)
取平均吸收值由标准曲线查得单位数，再由稀释倍数加以换算出弹性酶比活，并折算总
收率。
附：树脂处理：取干Amoerlite CG50树脂，水漂洗后加5倍体积l mol/LNaOH搅拌2h，水洗至中性。加5倍体积lmol/L HC1处理2h，水洗至中性，再用pH 4.5 0.1mol/L醋酸缓冲液平衡过夜。
【思考题】
1． 弹性蛋白酶制备的原理？
2． 影响弹性蛋白酶收率的因素有哪些？
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