实验二十九 超氧化物歧化酶的分离纯化
注：此实验内容来自校企合作课题，成果已经产业化应用
【目的要求】
1．通过超氧化物歧化酶的分离纯化，了解有机溶剂沉淀蛋白质以及纤维素离子交换柱层析方法的原理。
2．掌握测定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法。
【实验原理】
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）简称SOD，它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：铜锌超氧化物歧化酶（Cu·Zn-SOD）、锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和铁超氧化物歧化酶（Fe- SOD）。SOD催化如下反应：
O2十O2-·＋2H＋ → H2O2＋O2
在生物体内，它是一种重要的自由基清除剂，能治疗人类多种炎症、放射病及自身免疫性疾病，并具有抗衰老作用，对生物体有保护作用。
在血液里Cu·Zn-SOD与血红蛋白等共存于红血球中，当红血球破裂溶血后，用氯仿-乙醇处理溶血液，使血红蛋白沉淀，而Cu·Zn-SOD则留在水-乙醇均相溶液中。磷酸氢二钾极易溶于水，在乙醇中的溶解度甚低，将磷酸氢二钾加人水-乙醇均相溶液中时，溶液明显分层，上层是具有Cu·Zn-SOD活性的含水乙醇相，下层是溶解大部分磷酸氢二钾的水相（比重大）。用分液漏斗处理，收集上层具有SOD活性的含水乙醇相，再加入有机溶剂丙酮，使
SOD沉淀。极性有机溶剂能引起蛋白质脱去水化层，并降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒凝集而沉淀。采用这种方法沉淀蛋白质时，要求在低温下操作，并且需要尽量缩短处理时间，避免蛋白质变性。
Cu·Zn-SOD的pI为4.95。将收集的SOD丙酮沉淀物溶于蒸馏水中，在pH7.6的条件下，Cu·Zn-SOD带负电，过DE-32纤维素阴离子交换柱可得到进一步纯化。目前常用的活性测定方法为邻苯三酚自氧化法，该法所用试剂和仪器比较普通，测试方便，灵敏度高，是目前应用最广泛的一种测试方法，但对温度、PH、邻苯三酚浓度、SOD待测液存放时间等诸因素比较敏感,因此测定时要严格控制这些因素。
本实验以新鲜猪血为原料，通过氯仿-乙醇除去杂蛋白，采用DE-32纤维素进行纯化，并用邻苯三酚法测定SOD的活力。
【实验材料】
1．材料
新鲜猪血。 2．器材
（1）离心机 1台 （2）G3漏斗 1只 （3）抽滤瓶 1只 （4）751型分光光度计 1台 （5）梯度混合器 1台 （6）玻璃柱 1.0cm×10 cm 1根 （7）试管 100支
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（8）自动收集器 1台 （9）紫外检测仪 1台 （10）移液管 5ml 、1ml 各2支 （11）量筒 1 000ml 、100ml 各1只 （12）烧杯 1 000ml 、500ml、200ml 各2只 （13）分液漏斗 1只 3．试剂
（1）0.9％NaC1；
（2）95％乙醇，氯仿，K2HPO4·3H2O，丙酮； （3）pH7.6，2.5mmol/L磷酸钾缓冲液； （4）pH7.6，200 mmo1/L磷酸钾缓冲液； （5）10 mmo1／L HCl；
（6）6mmol/L邻苯三酚（用10mmol／L HCl作溶剂配制），4℃下保存； （7）2.5％草酸钾，DE-32纤维素；
（8）pH8.2，100mmol/L Tris-二甲胂酸钠缓冲液（内含2mmol/L二乙基三氨基五乙酸）：以200 mmol/L Tris二甲胂酸钠溶液（内含4m mol/L二乙基三氨基五乙酸）50 ml加200m mol/L HC1 22.38 ml，然后用重蒸水稀释至100ml。
【实验方法】
1．酶的制备
（l）分离血球：取新鲜猪血500ml（加人抗凝剂2.5％草酸钾50ml），3 000r/min离心20 min除去血浆，收集红细胞约250 ml，加人等体积0.9％NaC1溶液，用玻璃棒搅起充分洗涤，3 000r/min，离心20 min，弃去上清液（如此反复3次），收集洗净的红细胞放入800ml烧杯中，加250 ml重蒸水，将烧杯置于冰浴中搅拌溶血40 min以上，得溶血液500ml。 （2）向溶血液缓慢加入在4℃下预冷过的95％乙醇125ml（0.25倍体积），然后再缓慢加入在4℃下预冷过的氯仿75 ml（0．15倍体积），搅拌15 min，室温下3 000r/min离心20 min，弃去沉淀（血红蛋白），收集上清液约330 ml（留样2ml测酶活和蛋白含量）。此即酶的粗提液。
（3）向酶粗提液加入K2HPO4·3H2O（按43gK2HPO4·3H2O／100 ml粗提液的比例），转移到分液漏斗，振摇后静置15 min，见分层明显。收集上层乙醇-氯仿相（微混浊），室 温下离心（3 500r/min）25 min，弃去沉淀，得上清液约150 ml（留样1.5ml测酶活和蛋白含量）。
（4）向上一步得到的上清液加入0.75倍体积在4℃下预冷过的丙酮，Cu·Zn-SOD便沉淀下来。室温下3 500r/min离心20 min，收集灰白色沉淀物。将此灰白色沉淀物溶于约5ml重蒸水中（呈悬浮状），在4℃下，对250 ml pH7.6，2.5mmol/L的磷酸钾缓冲液透析，每隔0.5h以上，换透析外液l次，共换4次~5次。透析内液如出现沉淀，需在室温下3 500r/min离心25min~30 min，弃去沉淀，收集上清液约7ml（留样0.5ml）。 （5）DE-32纤维素柱层析
DE-32纤维素的处理：称量DE-32纤维素干品5g~6g，用自来水浮选除去1min~2 min不下沉的细小颗粒，用G3烧结漏斗抽干，滤饼放入烧杯中，加适量1mol/L NaOH溶液，搅匀后放置15 min，用G3烧结漏斗抽滤，水洗至中性，滤饼悬浮于1mol/L HC1溶液中，搅匀后放置10 min后用G3烧结漏斗抽滤。水洗至中性，滤饼再悬浮于1 mo1/L NaOH溶液中，抽滤，水洗至中性，最后将滤饼悬浮于层析性平衡缓冲液中待用。
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DE-32纤维素使用后的回收处理与上述步骤相同，只是不用HC1，所用NaOH浓度改为0.5 mol/L。将上一步所得离心上清液过DE-32纤维素柱。柱体l.0cm×6cm，用pH7.6，2.5mmol／L磷酸钾缓冲液作层析柱平衡液，用pH7.6，2.5mmol／L（100 ml）~200mmol／L（100 ml）的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱。流速30 ml/h，每管收集3ml。 2．酶蛋白浓度的测定
采用紫外吸收法，先测定不同已知浓度标准酪蛋白在280 nm波长处的光吸收值。绘出标准曲线作定量的依据，再测定样品在280 nm波长处的光吸收值，从标准曲线上查出待测样品的蛋白浓度。
3．酶活性的测定
本实验采用邻苯三酚自氧化法。邻苯三酚自氧化的机理极为复杂，它在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2，生成带色的中间产物。反应开始后，反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30s~45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4 min的范围内。中间物在420 nm波长处有强烈光吸收，当有SOD存在时，由于它能催化O2－与H十结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间物的积累，因此，通过计算就可求出SOD的酶活性。
邻苯三酚自氧化速率受pH、浓度和温度的影响，其中pH影响尤甚，因此，测定时要求对pH严格掌握。
（1）邻苯二酚自氧化速率的测定
在试管中按下表1加入缓冲液和重蒸水，25℃下保温20 min，然后加入25℃预热过的邻苯三酚（对照管用10 mmol／L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在420 nm波长处测定A值，每隔30s读数一次，要求自氧化速率控制在0.060A／min（可增减邻苯三酚的加入量，使速率正好是0.060A/min）。 （2）酶活性的测定
酶活性的测定按表2加样，操作与测定邻苯三酚自氧化速率相同。根据酶活性情况可适当增减酶样品的加入量。
酶活性单位的定义：在1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％时的酶量定义为一个活性单位，即在420 nm波长处测定时，0.030A／min为一个活性单位。若每分中抑制邻苯三酚自氧化速率在35%~65％范围，通常可按比例计算，若数值不在此范围时，应增减酶样品加入量。
邻苯三酚自氧化速率测定加样表
试剂
PH8.2 100mmol/L Tris-二甲胂酸纳缓冲液（内含2 mmol/L二
乙基三氨基五乙酸）
重蒸水 10 mmol/L HCl 6 mmol/L 邻苯三酚
总体积
4.2 0.3 _ 9
4.2 _ 0.3 9
0.2
对照管/ml
4.5
样品管/ml
4.5
最终浓度mmol/L 50
－
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酶活性测定加样表
试剂
PH8.2 100mmol/L Tris-二甲胂酸纳缓冲液（内含2 mmol/L二乙基三
氨基五乙酸）
酶溶液 重蒸水 6 mmol/L 邻苯三酚 10 mmol/L HCl
总体积
（3）活性和比活的计算公式
总活性单位＝每毫升酶液活性单位（U/ml）×酶原液总体积
每毫升酶液活性单位（U/ml）比活＝ ＝
每毫升蛋白浓度（mg/ml） 总活性单位（U） 总蛋白（mg） — 4.2 — 0.3 9 0.1 4.1 0.3 — 9 0.2 对照管/ml
4.5
样品管/ml
4.5
最终浓度mmol/L
【思考题】 1．SOD对人体有何生物学意义？
2．有机溶剂沉淀SOD根据的原理是什么？
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实验三十 重组门冬酰胺酶Ⅱ的纯化与分析
注：此实验来自项目重组E.coli L-门冬酰胺酶制备研究（科技部）的成果
【目的要求】
1．了解基因工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白及表达酶蛋白纯化、分析鉴定的基本原理。
2．掌握以基因工程菌种E.coli/pANS2为材料进行工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白重组门冬酰胺酶Ⅱ及表达酶蛋白制备和酶活力测定、SDS-PAGE电泳分析鉴定的工作原理和技术方法。
【实验原理】
L-门冬酰胺酶(L-asparaginase，EC3.5.1.1)广泛存在于动物的组织、细菌、植物和部分啮齿类动物的血清中，但在人体的各种组织器官中的分布未见报道。L-门冬酰胺酶活性形式为一同源四聚体，每一亚基由330个氨基酸组成，分子质量为34 564u，能专一地水解L-门冬酰胺生成L-门冬氨酸和氨。由于某些肿瘤细胞缺乏L-门冬酰胺酶合成酶，细胞的存活需要外源L-门冬酰胺的补充，如果外源门冬酰胺被降解，则由于蛋白质合成过程中氨基酸的缺乏，导致肿瘤细胞的死亡。因此，L-门冬酰胺酶是一种重要的抗肿瘤药物，多年来一直是小儿急性成淋巴细胞性白血病(Acute Lumphoblastic Leukaemia,ALL)和淋巴肉瘤(Lymphosarcoma)临床化疗中重要的配伍药物之一。
用微生物，特别是大肠杆菌来生产L-门冬酰胺酶已有广泛深入的研究。大肠杆菌能产生2种天冬酰胺酶，即L-门冬酰胺酶Ⅰ和L-门冬酰胺酶Ⅱ，分别由其染色体上基因ansA和ansB编码。只有L-门冬酰胺酶Ⅱ才有抗肿瘤活性。美、德、日均有L-门冬酰胺酶Ⅱ商品出售。我国天津生化厂曾于1974年投产，后因菌种退化，产量降低而停产。国内目前用药全靠进口。1995年，本院构建了高效分泌表达L-门冬酰胺酶Ⅱ的基因工程菌， 重组L-门冬酰胺酶Ⅱ(rL-ASPⅡ)在大肠杆菌细胞中合成后分泌到细胞周质中。表达的rL-ASPⅡ相对分子质量为138 356 Da，pI为4.85，紫外最大吸收值在278nm处。
本实验以此工程菌为材料采用蔗糖溶液渗透振扰提取法和酶解法联用提取周质中的rL-ASPⅡ，再用硫酸铵分级沉淀、DEAE-52阴离子纤维素交换层析等步骤提取和纯化，得到较高纯度表达产物rL-ASPⅡ。并对rL-ASPⅡ进行酶活力分析和12%SDS-PAGE电泳分析。 rL-ASPⅡ酶活性的测定参照Peterson的方法修订。取1 ml0.04 mol/L L-门冬酰胺，1 ml 0.1 mol/L pH8.4硼酸-硼酸钠缓冲液，0.2 ml细胞悬液或酶液于37℃保温15 min，速加1 ml 50%三氯乙酸终止反应，4 000 r/min离心沉淀细胞。取上清液1 ml，加奈氏试剂2 ml和双蒸水7 ml，放置15 min后，于500 nm波长比色。在上述规定条件下，将每分钟催化L-门冬酰胺水解释放1μg分子氨所需的酶量定义为1个酶活力单位（OD500=0.07时为1 U）。
比活力测定方法为：精称纯化产物10mg，溶解于1 ml H2O中，采用Lowry法测定蛋白质含量，并测定酶活力，经以下公式换算即得单位质量的rL-ASPⅡ比活力。rL-ASPⅡ比活力=酶活力(U)/蛋白含量。
【实验材料】
1．器材
（1) 基因工程菌菌种：E.coli/pANS2为本实验室保存；
（2) 其他同前实验二十三器材。
2．试剂
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