※ 实验一 糖的性质实验
糖的颜色反应
※ 实验一（1）
【实验目的及要求】
1. 掌握莫式（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。 2. 掌握塞式（Seliwanoff）试验鉴定酮糖的原理和方法。 【实验原理】
1．莫式试验：糖经无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与а-萘酚生成紫红色缩合物。
2．塞式试验：酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕红色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。 【实验仪器及用品】
仪器：水浴锅。 器皿：吸管、试管。
实验药品：蔗糖、葡萄糖、淀粉、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、а-萘酚、浓硫酸、95%乙醇、间苯二酚、盐酸、间苯三酚。 【实验试剂】
莫式试剂：а-萘酚5g,溶于95%乙醇并稀释至100ml。现用现配，并贮于棕色试剂瓶中。 塞式试剂：间苯二酚50mg，溶于100ml盐酸（VH2O：VHCl=2:1），现用现配。 【实验内容及步骤】
一、莫式实验
于4支试管中，分别加入1 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1 ml水中），然后各加莫式试剂2滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5 ml（切勿振摇！），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。
二、塞式试验
于4支试管中，分别加入0.5 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液，然后各加塞式试剂2.5ml，摇匀，同时置沸水浴内，比较各管颜色及红色出现的先后顺序。 【实验现象观察并记录】
仔细观察实验中的颜色变化，对于塞式试验和杜式试验还需记录下颜色变化的时间。
※ 实验一（2）
【实验目的及要求】
掌握糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法。 【实验原理】
费林(Fehling)试剂和本尼迪(Benedict)试剂均为含Cu2+的碱性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色或黄色的Cu2O，此法常用作还原糖的定性或定量测定。
【实验仪器及用品】
实验仪器：水浴锅 实验器皿：吸管、试管
实验药品：硫酸酮、氢氧化钠、酒石酸钾钠、柠檬酸钠、无水碳酸钠、淀粉、蔗糖、葡萄糖。 【实验试剂】
1. 费林试剂
试剂A：CuSO4·5H2O 34.5 g,溶于蒸馏水并稀释至500 ml。
试剂B：氢氧化钠125 g，酒石酸钾钠137 g，溶于蒸馏水并稀释至500 ml。 临用时将试剂A与试剂B等体积混合。
2. 本尼迪试剂：柠檬酸钠（Na3C6H3O7·11H2O）及50 g无水碳酸钠，溶于400 ml蒸馏水中。另溶解8.5 g硫酸铜于50 ml热水中。将硫酸铜溶液缓缓加入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤。此混合液可长期使用。 【实验内容及步骤】
于3支试管中加入费林试剂A和B各1 ml，混匀，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1 ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化。 另取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1 ml，然后每支试管加本尼迪试剂2 ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，和上面结果比较。
糖的还原作用
※实验一（3） 总糖的测定——蒽酮比色法
【实验目的】
1、 学习蒽酮比色定糖法的原理和方法。 2、 学习721型分光光度计的原理和操作方法。 【实验原理】
总糖是指样品中的还原单糖及在本法测定条件下能水解成还原单糖的蔗糖、麦芽糖和可部分水解为葡萄糖的淀粉。
蒽酮比色法是测定样品中总糖量的一个灵敏、快速、简便的方法。其原理是糖类在较高温度下被硫酸作用脱水生成糠醛或糠醛衍生物后与蒽酮（C14H10O）缩合成蓝色化合物。溶液含糖量在每mL150μg以内，与蒽酮反应生成的颜色深浅与糖量成正比。蒽酮不仅能与单糖也能与双糖、糊精、淀粉等直接起作用，样品不必水解。
721型分光光度计为上海第三分析仪器厂产品。采用自准式光路，单光束方法。其波长范围为360～800nm，用钨丝白炽灯为光源。由灯泡发出的连续辐射光线，经过聚光透镜会聚后，再经过平面镜转90角。光线反射后，经入射狭缝而入射到单色器内。狭缝正好位于球面准直物镜的焦面上。当入射光线经过准直物镜反射后，就以一束平行光射向棱镜，并在其中色散。入射角在最小偏向角，入射光在铝面上依原路反射回来，再经过准直物镜反射，而会聚在出光狭缝上。由狭缝出来的光通过被测的溶液，再射到GD-7型光电管上。GD-7型光电管的锑、铯、钾、钠阴极面对整个可见光区都较敏感（光谱灵敏范围为350～850nm）。光电管受光后所产生的光电流，经过一组高值电阻（50M、500M、1KMΩ），在电阻两端形成一个电压降，通过电压降的测定来间接地测量光电流的变化。
【器材】
1、试管（或具塞试管）及试管架 2、吸量管（1mL、10mL） 3、沸水浴 4、冰浴 5、721型分光光度计 【试剂和材料】
1、蒽酮试剂（1000mL）:称取100mg蒽酮溶于100mL98%硫酸溶液（A.R）中，用时配制。 2、葡萄糖标准溶液（100μg/mL） ：精确称取100mg干燥葡萄糖，用蒸馏水定溶至1000mL。 3、样品溶液：可自选待测物制成样品溶液。
举例：称取500g市售白薯，洗净切碎后用多功能食品加工机磨成浆，4层沙布压虑，去滤液留渣，将渣放入烘箱内80～85C烘干后，再用植物粉碎机（微型）研细，过筛，取
0
0
100目筛下物为待测样品。取样品在烘箱内105C烘干，恒重后，精确称取1～5g，置于锥形瓶中，加入80mL沸蒸馏水，放入沸水浴。不时摇动，提取半小时。取出立即过滤，残渣用沸蒸馏水反复洗涤并过滤，合并滤液。冷却至室温，用蒸馏水定溶至100mL。
【实验操作】
1、制作标准曲线 取7支干燥洁净的试管，编号后按下表操作。
试剂（mL） 编号 葡萄糖标准溶液（100μg/mL） H2O 蒽酮试剂 1 0 2 3 4 5 6 7 0
0.10 0.20 0.30 0.40 0.60 0.80 1.0 0.90 0.80 0.70 0.60 0.40 0.20 10 10 10 10 10 10 10 每管加入葡萄糖标准溶液和水后立即混匀 ，迅速置于冰浴中，待各管都加入蒽酮试剂后，同时至于沸水浴中，准确加热7分钟，立即取出置冰浴中迅速冷却。待各管溶液达室温后，用1cm厚度的比色皿，以第一管为空白，迅速测其余各管的光吸收值。然后以第2管～7管溶液含糖量μg数为横坐标，吸光度（A620nm ）为纵坐标，画出含糖量与A620nm值的相关标准曲线。
2、测定样品的含糖量 取4支试管编号，按下表操作。
试剂（mL） 编号 样品溶液 H2O 蒽酮试剂 1 0 1.0 10.0 2 1.0 0 10.0 3 1.0 0 10.0 4 1.0 0 10.o 其它操作与制作标准曲线相同。将2～4管测出的A620nm平均值，根据A620nm平均值从标准曲线上查出相应的含糖μg数，在换算成100g样品中总糖含量。
【注意事项 】
1、所配制的样品溶液必需透明，样品中如有蛋白质，对实验有影响，须设法除去。 2、在操作中必须严格控制反应过程的温度和加热时间。
3、在使用浓硫酸时一定要格外小心，防止硫酸溅到身上而损坏衣服。
总糖=样品重量 样品水解后还原糖mg数×样品稀释倍数×100
※实验二 纸层析法分离鉴定氨基酸
【实验目的】
1、学习分配层析的原理；
2、掌握氨基酸纸上层析的操作技术。
【实验原理】
层析法也叫色谱法，是一种物理分离方法，它是利用混合物中各组分的物理、化学性质的差异，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定相，另一个相则流过此固定相（称流动相）并使各组分以不同的速度移动从而达到分离。
层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似而用一般化学方法难以分离的各种化合物。如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。
层析法有许多种类，根据分离所依据的理化性质不同，可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。
纸层析是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一中分离分析工具。纸层析属于分配层析法。分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而得到分离。纸层析以滤纸作为惰性支持物，滤纸纤维素上的羟基具有亲水性，能吸附一层水，把吸附在滤纸上的水作为固定相，展层用的有机溶剂为流动相。层析时，将样品在距离滤纸2~3cm的某一处（原点），在密闭的容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向反复抽提，由于混合氨基酸在两相中的分配系数（当把一种物质在两种不相溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀分配。达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比为一个常数，即所谓的分配常数）不同，使不同的氨基酸分布在滤纸的不同位置上而得到分离。
物质被分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上移动的速率用Rf表示。 Rf = 原点到层析点中心的距离（X）÷ 原点到溶剂前沿的距离（Y）。
在一定条件下某种物质的Rf值是一个常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度有关。