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※实验九 维生素C的定量测定
【实验目的】
1．学习维生素C定量测定法的原理和方法。 2．进一步熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技术。 【实验原理】
测定维生素C（抗坏血酸）的化学方法，一般是根据它的还原性。本实验即利用维生素C的这一性质，使其与2，6--二氯酚靛酚作用。2，6―二氯酚靛酚钠盐的水溶液呈蓝色，在酸性环境中为玫瑰色，当其被还原时，则脱色。根据上述反应，利用2，6―二氯酚靛酚在酸性环境中滴定含有维生素C的样品溶液。开始时，样品液中的维生素C立即将滴入的2，6―二氯酚靛酚被还原脱色，当样品液中维生素C全部被氧化时，再滴入的2，6一二氯酚靛酚就不再被还原脱色而呈玫瑰色。故当样品液用2，6―二氯酚靛酚标准液滴定时，溶液出现浅玫瑰色时表明样品液中的维生素C全部被氧化，达到了滴定终点。此时，记录滴定所消耗的2，6―二氯酚靛酚标准液量，按下述公式计算出样品液中还原型维生素C的含量。
计算公式：
式中：VA为滴定样品提取液所用的2，6―二氯酚靛酚的平均mL数； VB为滴空白对照所用的2，6―二氯酚靛酚的平均mL数； S为1mL2，6―二氯酚靛酚溶液相当于维生素C的mg数； W为10mL样品提取液中含样品的g数。 【器材】
1．研钵 2．吸量管（10mL） 3．容量瓶（50mL） 4．锥形瓶（50mL）
5．微量滴定管（5mL） 6．漏斗
7．纱布 8．滤纸 9．药物天平 【试剂和材料】
1．绿豆芽 800g 2．10%盐酸溶液 1500mL 3．2，6―二氯酚靛酚溶液 2000mL
称取0.21g碳酸氢钠，0.26g 2，6―二氯酚靛酚溶于250mL蒸馏水中，稀释至1000mL。过滤，装入棕色瓶内，置于冰箱内保存，不得超过3天。使用前用新配制的标准抗坏血酸溶液标定。取5mL标准抗坏血酸溶液加入5mL偏磷酸―醋酸溶液。然后用2，6―二氯酚靛酚溶液滴定，以生成为微玫瑰红色持续15秒钟不退为终点。计算2，6―二氯酚靛酚溶液的浓度，以每mL2，6―二氯酚靛酚溶液相当于抗坏血酸的mg数来表示。
4．标准抗坏血酸溶液：准确称取纯抗坏血酸结晶50mg溶于偏磷酸―醋酸溶液定容到250mL。装入棕色瓶，贮于冰箱内。
5．偏磷酸―醋酸溶液：称取偏磷酸15g，溶于40mL冰醋酸和450mL蒸馏水所配成的混合液中。过滤。贮于冰箱内，此液保存不得超过10天。 【实验操作】
1、
制备含维生素C的样品提取液：称取30g绿豆芽（37C发芽3～7天）置研钵中研磨，放置片刻（约10分钟），用2层纱布过滤，将滤液（如混浊可离心）滤入50mL容量瓶中。反复抽提2～3次，将滤液并入同一容量瓶中。最后，用酸化的蒸馏水定容，混匀，备用。
2、
量取样品提取液10mL于锥形瓶中，用微量滴定管，以2，6―二氯酚靛酚溶液滴定样品提取液，呈微弱的玫瑰色，持续5秒钟不退为终点，记录所用2，6―二氯酚靛酚的mL数。整个滴定过程不要超过2分钟。另取10mL用10%盐酸酸化的蒸馏水做空白对照滴定。
3、 4、
样品提取液和空白对照各做三份。 计算结果。
0
【注意事项】：本实验所用的方法简便，但不够准确，其原因如下：
1、生物组织提取液中维生素C还能以脱氢和结合的形式存在。这两种形式的维生素C都具有还原型维生素C的生物活性，却不能将2，6―二氯酚靛酚还原脱色。
2、生物组织提取液中含有天然色素，干扰对滴定终点的观察。
※ 实验十
【实验目的】
1、学习分光光度计的原理和使用方法。 2、学习测定淀粉酶活力的方法。 3、了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 【实验原理】
几乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌发的禾谷类种子，淀粉酶活性最强。淀粉酶是水解淀粉糖苷键的一类酶的总称。包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化淀粉酶、异淀粉酶等。实验证明在小麦、黑麦的休眠种子中直含有α-淀粉酶和β-淀粉酶。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1,4-糖苷键，作为淀粉分解的起始酶而起主要作用；其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖；β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1,4-糖苷键，水解产物为麦芽糖，并能使一部分糊精糖化。本实验观察小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。
淀粉的水解产物麦芽糖及其它还原糖能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
【仪器与用具】
分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；具塞刻度试管（25ml×13）；刻度吸管（1ml，2ml，5ml各1支）；容量瓶（50ml×2）。
【试剂】 1、小麦种子
2、0.1%标准麦芽糖溶液：称取100mg麦芽糖，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中并定容至刻度。
小麦种子萌发时淀粉酶活力的测定
3、1%DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸试剂）：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20ml 2mol/L 的NaOH溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。
4、pH6.9，0.02 mol/L磷酸缓冲液：
0.2 mol/L 磷酸二氢钾67.5mL与0.2 mol/L 磷酸氢二钾82.5mL混合稀释10倍。 5、1%淀粉溶液：称取1g可溶性淀粉溶于100ml 0.02 mol/L磷酸缓冲液，其中含有0.0067mol/L氯化钠。
6、1%氯化钠溶液 7、海砂 【实验操作】
1、种子发芽：小麦种子浸泡2.5小时后，放入250C恒温箱内或在室温下发芽。 2、酶液提取：
（1）幼苗酶的提取：取25℃下萌发3～4天的小麦幼芽（芽长1.0~1.5cm）15株，置研钵中，加少量石英砂（200mg），加1%氯化钠溶液10mL，用力研磨成匀浆，在室温下放置20分钟，搅拌几次，使其充分提取。然后将提取液转入离心管中，在3000r/min转速下离心10min，将上清液倒入量筒中，测定酶提取液的总体积。取酶液1mL用缓冲液将酶提取液稀释10倍，进行酶活力测定。
（2）种子酶的提取：将干燥的种子或浸泡2.5小时后的种子15粒作为对照（提取步骤同上）。
3.酶活力的测定：取25mL刻度试管4支,编号,按下表进行操作。
试管 试剂 标号 （mL） 酶提液 0.1%标准麦芽糖溶液 1%淀粉溶液 蒸馏水 1 干燥（或浸泡2.5小时）种子的酶提液 0.5 —— 1 —— 2 发芽3或4天幼苗的酶提液 0.5 —— 1 —— —— 0.5 1 —— 3 标准管 4 空白管 —— —— 1 0.5 将各管摇匀，放在25oC恒温水浴中保温3min水解后，立即向各管中加入1%DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸试剂）2mL。
取出各试管，放入沸水浴中加热5min。冷却至室温，加水稀释至25mL。将各管充分混匀。用空白管作为对照，在A500nm处测定各管的光吸收值。将读数填入下表。
试管号 1、干燥（或浸泡2.5小时）种子的酶提液 发芽3或4天幼苗的酶提液 标准管 空白管 A500nm 【计算】
根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：
A标准A未知=C标准C未知：则C（酶液管中麦芽糖的浓度）=A酶×C标准A标准
式中：C为浓度；A为光吸收值。
本实验规定：在25oC时3分钟内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为一个酶活力单位。
则15粒种子或15株幼苗的总活力单位= C酶×n酶 × V酶 式中：C酶为酶液中麦芽糖的浓度； n酶为酶液稀释倍数； V酶为提取酶液的总体积。 【注意事项】
1、小麦种子萌发前须充分浸泡24小时，然后均匀的放在铺有滤纸的培养皿或解剖盘中，开始2～3天内须保证水分充足，根系发达后浇水不可过多。
2、萌发情况不同，酶活力也不同：刚萌发出胚根的小麦，酶活力增加迅速，之后，虽发芽天数的增加而增加，但幅度减慢，同一天发芽的幼苗高株比矮株的酶活力略高。
3、酶提取温度应控制在0～4oC，因为低温条件下易保持酶的活力。 4、酶液中麦芽糖含量的测定也可用标准曲线法。 【思考题】
1、为什么此酶的提纯整个过程须在0～4oC条件下进行？而测酶活力时要在25oC预保温？反应后又放入沸水浴中？
2、小麦萌发过程中淀粉酶活性升高的原因和意义是什么？