【器材与试剂】
1、器材：
层析缸、点样毛细管、小烧杯、培养皿、量筒、喷雾器、吹风机（或烘箱）层析滤纸（新华1号），直尺、铅笔、针线、一次性手套。
2、试剂：
（1）扩展剂（水饱和的正丁醇和乙酸的混合物。其中水为固定相，正丁醇为流动相 ，乙酸为层析提供酸性环境。）
具体配制方法：将20mL正丁醇和5mL乙酸（4：1）放入分液漏斗中，与15mL蒸馏水混合（即所得混合液再按体积比5：3与蒸馏水混合）,充分振荡，静止后分层，放出下层水层，取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡剂，其余的倒入培养皿中备用。
（2）氨基酸溶液：0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组分的浓度均为0.5%）。
（3）显色剂：0.1%水合印三酮正丁醇溶液。
【操作方法】
1、制备扩展剂并将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。 2、准备滤纸
取层析滤纸（长22cm，宽14cm）一张，在纸的一端距边缘2~3cm处用铅笔划一条直线，在直线上每间隔2cm作一记号，为点样位置。
3、点样：
用毛细管将各氨基酸样品分别点在点样处，干后再点一次。点样量以30~40μL为宜，点样时，用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰点样处，每点在纸上扩散的直径不超过3mm。
4、扩展：用线将点好样品的滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触（避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动过快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值）。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端朝下，扩展剂的液面需低于点样线1cm），待溶剂上升15~20cm时取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，用吹风机吹干（注意温度不宜过高，以免损坏氨基酸）。
5、定性鉴定：
用0.1%水合印三酮正丁醇溶液在纸的一面均匀喷雾，然后置烘箱中烘烤5分钟（100oC）即可显示出各层析斑点。用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，用一直尺测量每一显色斑点中心与原点的距离和原点到溶剂前沿的距离，求其比值，即得各种氨基酸的Rf值。
在层析图谱上，对比标准氨基酸的位置（Rf值）而确定氨基酸混合样品中氨基酸的种类位置
6、计算各种氨基酸的Rf值。
【注意事项】1、取滤纸之前
亮氨酸 要将手洗干净，防止手上的汗渍污
苯丙氨酸 缬氨酸 染滤纸，并尽可能少接触滤纸；在条件允许的情况下也可戴一次性手套拿滤纸。要将滤纸平放在干净的白纸上，千万不要放在实验台
脯氨酸 赖氨酸 上，以防止污染。
2、点样点的直径不能超过
0.5cm，否则分离效果不好，并且样品用量过大，会造成“托尾巴”现象。
【思考题】
1、纸层析法的原理是什么？
2、何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？ 3、怎样制备扩展剂？
4、层析缸中平衡剂的作用是什么？ 5、氨基酸极性与Rf值的关系？
附：影响Rf值的因素
1、物质结构的影响：极性物质易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质易溶于非极性溶
剂（有机溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸的极性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配较多，因此Rf值低于后者。氨基酸的极性愈大，Rf值愈小。
—CH2—基是疏水性基团，如果分子中极性基数不变，则—CH2—基增加，整个分子的极性降低，因此易溶于有机溶剂（流动相）中，Rf值也随之增加。例如氨基酸的Rf值 ：甘氨酸〈 丙氨酸 〈 亮氨酸 ；二羧基氨基酸中，天门冬氨酸〈 谷氨酸。
极性基团的位置不同也会引起Rf值变化。
2、溶剂的影响：同一种物质在不同溶剂中Rf值不同，选择溶剂系统时应该使被分离物质在适当Rf值范围内（0.05-0.85之间），并且不同物质的Rf值至少差别为0.05才能彼此分开。
溶剂的极性大小也影响物质的Rf值，在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的Rf值随着溶剂碳原子数目的增加而降低。
3、pH的影响：溶剂系统地pH会影响物质极性基团的解离形式。对于酸性氨基酸则在酸性时所带净电荷比碱性时少。带电荷愈少亲水性愈小，因此在酸性溶剂中Rf值较碱性大。而碱性氨基酸则与此相反。借此性质用酸相和碱相溶剂进行双向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。
溶剂的pH还可以影响有机溶剂的含水量，溶剂酸碱度大，则含水量高。对于极性物质来说Rf值增加，非极性物质则减少。若pH值不适合，使同种物质有不同解离形式，其Rf值也略有不同，则此物质层析呈带状图谱。因此溶剂中的酸或碱的含量必须足够，并且层析缸中用酸或碱气体饱和才可以防止上述现象，使物质得到圆点状图谱。
4、滤纸的影响：层析滤纸必须质地均匀、紧密、有一定机械强度，并且杂质较少，如纸中有Ca、Mg、Cu等金属离子杂质，可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴影，可用稀酸洗涤滤纸除去之。
5、温度和时间的影响：温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤维素的水合作用。温度变化对Rf值影响很大，所以层析时最好在恒温室中进行，控制温度相差不超过±0.5C。当所有条件相同时，氨基酸层析时间短，Rf值则小。
除上述影响因素外，样品中含有盐份和其它杂质以及点样过多均会影响样品的有效分离。
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※实验三
【实验目的】
血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
熟悉醋纤薄膜电泳方法及其在分离血清蛋白中的应用，了解电泳技术的一般原理。
【实验原理】
蛋白质是兼性离子。由于组成蛋白质分子的氨基酸种类和数目不同，各种血清蛋白质的分子量和等电点也不相同。在同一条件下(电场强度、电渗、温度、缓冲液pH和离子强度等)，它们电泳速度各不相同，因而可以分离。本实验以醋酸纤维薄膜为支持物，利用血清中蛋白质颗粒的等电点大部分低于7，在缓冲液pH8.6中带负电荷，在电场中向正极移动，电泳后根据血清蛋白移动快慢，可依次分为清蛋白、球蛋白的α1、α2、β、γ五个区带，染色后显出清晰色带。由于各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比，可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中，用分光光度法计算各种蛋白质的百分数，也可以将染色后的膜条直接用光密度计测定。
图1 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图
1为清蛋白，2，3，4，5分别α1-，α2-，β-及γ-球蛋白，6为点样原点
醋酸纤维薄膜电泳（cellulose acetate membrane electrophoresis）具有微量、快速、简便及分辨率较高等优点，广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定。
醋酸纤维薄膜与滤纸相比较，有以下优点：
（1）醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了定量测量的精确性。
（2）快速省时。由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲溶液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45——60min即可，加上染色、脱色，整个电泳完成仅需90min左右。
（3）灵敏度高，样品用量少。血清蛋白电泳仅需2μL血清，甚至加样体积少至0.1μL，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离区带。临床医学检验利用这一特点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。
（4）应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白的等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。
（5）醋酸纤维薄膜电泳染色后，经冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。
【试剂】
1、巴比妥缓冲液(pH8.6，离子强度0.075)
称取巴比妥钠15.45g，巴比妥2.76g，用蒸馏水配成1000ml。 2、染色液
氨基黑10B0.25g，甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸馏水40ml混合配制（可重复使用）。 3、漂洗液：
95％乙醇45份，冰醋酸5份，蒸馏水50份。 4、0.4moL/LNaOH洗脱液： 取4克NaOH加蒸馏水至250ml。 5、透明液
冰醋酸25-30ml加95％乙醇70-75ml。
6、新鲜无溶血血清。 【器材】
电泳仪(包括整流器与电泳槽)与分光光度计或光密度计、染色缸、醋酸纤维薄膜（2×
8cm）、点样器、10ml吸管、大试管等、培养皿、滤纸、镊子、直尺、铅笔、剪刀等。
【操作】
1、准备：用镊子取2×8cm醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光泽面，并在角上用笔作上记号），在膜的粗面一端1.5cm处用铅笔轻划一横线，表示点样位置，将膜浸入巴比妥缓冲液中充分浸透（约20分钟），取出，夹在两层粗滤纸内吸去水分，，然后平铺在玻璃板上，膜的粗面朝上。另在电泳槽两边盛入巴比妥缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，取两层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。作为滤纸桥。
2、点样：用1.5cm宽的玻片末端或点样器蘸上一层血清，紧印在膜粗面点样线上使血清全部渗入膜内。
图2 醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图
虚线处为点样位置