3、电泳：将膜点样面向下，两端拉紧贴于电泳槽架的滤纸桥上，点样端在阴极，盖上槽盖，静置平衡5-10分钟后通电。电压先90v，10分钟；120 v ，50分钟(约10v／cm／长)电流0.4-0.6mA／cm宽，约45-60分钟关闭电源。若连续数次电泳，每次正负电极应转换。
图3 电泳装置剖视示意图
1.滤纸桥 2.电泳槽 3.醋酸纤维素薄膜 4.电泳槽膜支架
5.电极室中央隔板
人血清蛋白质的等电点及迁移率
蛋白质名称 清蛋白 α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白
等电点 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85-7.50
4、染色与漂洗：电泳完毕，取出膜条，直接浸入氨基黑10B染色液中，染色3-5分钟取出薄膜，立即浸入漂洗液中，时时漂盈，漂洗3-4次至背景无色为止，用蒸馏水冲洗后放室温凉干或放100℃以下干燥箱烘干。
【实验说明】
1、醋纤薄膜电泳血清蛋白正常值：清蛋白(A)：55-74％，α1球蛋白2-5％，α2球蛋白4-9％，β球蛋白6.5一12％，γ球蛋白12-20％，肝硬化时清蛋白显著降低，γ球蛋白升高2-3倍，肾病综合征时清蛋白质降低，α2、β球蛋白升高。
2、1957年Kohn首先用醋酸纤维薄膜电泳后，因其有微量快速、操作简便，分离清晰、电渗小无拖尾等优点，可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、血红蛋白、结合球蛋白及同功酶的分离和测定，应用日渐广泛。但在实际应用过程中，因影响因素较多：电压电流、电泳时间、血清加量、醋纤膜质量、染料质量和浓度、染色时间和染料应用的次数，漂洗的次数及每次间隔的时间、缓冲液的离子强度、透明液的醋酸浓度等都可影响醋纤膜电泳分析的结果。所以要完成好的电泳图谱有一定的难度。因此在实验中要注意解决以下几个问题： （1） 电泳图谱不齐或分离不良
泳动脉/(cm·V·S)
-5.9×10 -5.1×10 -4.1×10 -2.8×10
-5
-1.0×10
-5-5-5-5
2-1-1
分子量 69000 200000 300000 9000-150000 156000-300000
这是电泳分析中最常见的问题，多数是由于血清滴加不均匀或滴加过多，也有因薄膜质量不合要求所致。点样这一步非常关键，一定要按操作步骤进行。首先选择质匀、孔细、染料吸附少的薄膜充分浸透缓冲液至湿度均匀无干白点。然后将滤纸吸去薄膜表面的多余水份，使薄膜含水量饱和均匀，这样才能防止薄膜表面液体含量不均，水份移动而引起标本移位。点样前注意关闭门窗和风扇，因空气流通快可使标本和水份蒸发而影响电泳图形。点样要力求做到均匀迅速，在实践中把点样器干沾血清，改为沾取标本前先浸入蒸馏水中沾湿用吸水纸吸干后再沾血清，这样点样器内均匀沾取血清的效果较干沾为佳。 （2）电泳图谱出现条痕
问题是由于点样后薄膜过干，或因电泳槽密闭性不良，或电流过大，温度升高，薄膜水份蒸发干燥而造成的。因此薄膜一定要充分浸透后才能点样，并注意检查电泳槽是否盖紧，电泳槽要放在远离光源热源的阴凉之处。在电泳过程中随时观察电压电流的变化，因通电后产生一定的热量，电流会有所增加。控制电压100～110V，电流0.5～0.6mA/cm，电泳时间一般冬长夏短，以区带展开3.5～4cm即可(另加一条溴酚蓝预染血清，同样操作，指示区带展开的距离)。
（3） 区带拖尾或区带过于紧密
缓冲液的离子强度低于0.05即出现区带拖尾现象，离子强度>0.075则区带过于紧密。此时需要检查更换缓冲液。常规操作一般使用连续电泳巴比妥盐缓冲液pH8.6，离子强度0.06。电泳槽中缓冲液经10次使用后，不应简单地采取交换电极的方法，而是将缓冲液取出重新混合过滤后，再进行使用，一般用4个周期后需更换新液。离子强度愈低，区带展开愈长，电泳速度愈快。电泳区带展开的距离也跟薄膜数量有关。在教学实验中，经常发现薄膜愈少，展开的距离愈短，区带愈清晰的现象。在仪器输出电压相同的情况下，薄膜愈少，加在薄膜两端的电压愈高，电压高会使展开的长度缩短。只要薄膜数量在5条以上，即可使图谱展开长度有较好的重现性。
（4）区带一边长一边短呈现扭曲现象
这是薄膜两边电阻不一样，电阻大的一边电流小，速度慢，区带展开短。造成这种现象的原因是薄膜未紧压在电泳槽的滤纸桥上，使薄膜接触不良而增大了电阻。在操作过程中，一定要注意使薄膜两端紧压在滤纸桥上。
（5） γ球蛋白区带倒退
这是电渗作用引起的。可升高点样端的缓冲液面高度或适当加大电流量克服之。 （6）染色后白蛋白中间色浅
有些同学在实验中往往急于求成，染色时间未到便匆忙取出薄膜漂洗，结果造成了白蛋白区带中间色浅的现象。造成这种现象的另一个原因是白蛋白含量过高。可增加染色时间或减少点样量解决之。
（7）染色后区带清晰度不良
陈旧标本可使区带分离清晰度大为降低。应尽量当日标本当日做，最多不超过2天。另外标本不可溶血，因溶血标本中血红蛋白与β球蛋白的电泳区带相重迭。可造成β球蛋白含量升高而蛋白质含量相对减少的结果。
（8） 白蛋白区带染色不均并有空泡
这是染色液陈旧所致，染色液存放和使用过久，会降低蛋白质结合染料的能力。发现正在使用的染液已陈旧时，应立即全部弃去，更换新液。
（9） 透明时膜发白不能完全透明
薄膜未干或透明液中醋酸含量不足可造成膜发白而不能达到透明的目的，应将薄膜晾干，适当增加透明液的醋酸浓度。
（10） 透明时膜溶解
室内温度过高或透明液醋酸浓度过高均可使膜溶解。可采用适当降低透明液醋酸浓度的办法来解决。
3、醋酸纤维薄膜电泳，点样为什么在粗糙面？
醋酸纤维素薄膜本身就像包装药片的铝塑纸一样，它是由一层薄薄的聚乙烯和压附在其上的醋酸纤维素酯构成的。光滑一面是聚乙烯一面，唯有粗糙面是醋酸纤维素酯的一侧。所以自然要点在粗糙面上了。
4、注意电泳时，点样面朝下，点样端在负极。
※实验四 甲醛滴定法测定氨基酸
【实验目的】
初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作方法。
【实验原理】
氨基酸虽然是一种两性电解质，既是酸又是碱，但是它却不能直接用酸、碱滴定来进行定量测定。这是因为氨基酸的酸、碱滴定的等电点pH或过高（12~13）或过低（1~2），没有适当的指示剂可被选用。然而向氨基酸中加入过量的中性甲醛，用标准氢氧化钠滴定时，由于甲醛与氨基酸中的氨基作用形成羟甲基衍生物而降低了氨基的碱性，相对的增加了—NH3+的酸性解离，游离出氢离子，用NaOH滴定，从消耗的碱量可以计算出氨基酸的含量。此法称为间接滴定法。
反应式：
氨基酸的甲醛滴定是测定
R—CH—COO-←―→R—CH—COO-+H+—→中和
+
∣ ∣ OH NH3+ NH2 ↑
→HCHO
- R-CH-COO ∣ 羟甲基氨基酸 NHCH2OH →HCHO
- R-CH-COO
∣二羟甲基氨基酸
N(HCH2OH)2
氨基酸的一种常用方法。当氨基酸溶液中存在1mol/L甲醛时，滴定终点由pH12左右移至9附近，也即酚酞指示剂的变色区域内（PH9.0左右）。。如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基酸的含量。如蛋白质是多种氨基酸的混合物，如蛋白质的水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的
定量依据。但蛋白质在水解时，释放出游离的氨基，蛋白质合成时游离氨基减少，所以根据测定游离氨基的含量可来判断蛋白质水解或合成的程度。脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定毫升数偏低。而酪氨酸的滴定毫升数结果偏高。
【器材与试剂】
1、器材：25mL锥形瓶、3mL微量滴定管 、吸管。
2、试剂：（1）0.1mol/L标准甘氨酸溶液（准确称取750mg甘氨酸，溶解后丁容至100mL）；
（2）0.1mol/L标准氢氧化钠溶液；（3）酚酞指示剂（0.5%酚酞的50%乙醇溶液）； （4）中性甲醛溶液：在50mL36~37%分析纯甲醛溶液中加入1mL0.1%酚酞乙醇水溶液，用0.1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定至微红，贮于密闭的玻璃瓶中。
此试剂在临用前配制。如已放置一段时间，则使用前需重新中和。
【操作方法】
1、取3个25mL涮洗干净并干燥的锥形瓶，编号。向第1、2号锥形瓶内各加入2mL0.1mol/L标准甘氨酸溶液和5mL水，混匀。向第3号锥形瓶内加入7mL水。然后向3个锥形瓶中各加入5滴酚酞指示剂 ，混匀后各加2mL甲醛溶液，再混匀，分别用0.1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液呈微红色。记录各自消耗的0.1mol/L标准氢氧化钠溶液的mL数。按照上述的实验操作再做一次滴定并做好记录。
取滴定中各锥形瓶消耗的0.1mol/L标准氢氧化钠溶液mL数的平均值，计算甘氨酸氨基氮的回收率。
实际测得量 甘氨酸氨基氮的回收率% = × 100 加入理论量 实际测得量为滴定第1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液mL数的平均值与3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液mL数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以14.008 2mL乘以标准甘氨酸的摩尔浓度再乘以14.008，即为加入理论量的mg数。14.008为1ml 0.1mol/L 标准NaOH溶液相当的氮量（mg）。
2、取未知浓度的甘氨酸溶液2mL，以上述方法进行测定，平行做2份，取平均值。计算每mL甘氨酸溶液中含有甘氨酸的mg数。 （ V未 － V对）×mol/LNaOH ×14.008 氨基酸（mg/mL）= 2 式中： V 未 为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均mL数。V对为滴定对照液（3 号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均mL数。mol/LNaOH为标准氢氧化钠溶液的真实摩尔浓度。 【注意事项】1、标准氢氧化钠溶液应在临用前标定，并在密闭瓶中保存。不可使用隔日贮存在微量滴定管中的剩余氢氧化钠溶液。 2、本实验为定量实验，甘氨酸和氢氧化钠的浓度要严格标定，加量要准确，全部操作要按分析化学的要求进行。 【思考题】运用酚酞指示剂，为什么滴定的是氨基？