※实验五 酪蛋白的制备
【实验目的】
学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。
【实验原理】
牛乳中的主要蛋白质是酪蛋白，含量约为35克/升。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白沉淀吸出。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白（酪蛋白不溶于乙醇）。
【实验器材与试剂】
器材：离心机，抽虑装置，精密pH试纸或酸度计，电炉，烧杯 ，温度计，分析天平。 材料与试剂：牛奶，95%乙醇，无水乙醚，0.2mol/LpH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液（配制方法：先配置液A液（0.2mol/L醋酸钠溶液）和B液（0.2mol/Lp醋酸溶液）。称取NaAc.3H2O54.44克，定容到2000mL即得A液，称取优级纯醋酸（含量大于99.8%）12.0克定容至1000mL即得B液。取A液1770mL,B液1230mL混合即得pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液3000mL，乙醇-乙醚混合液（乙醇：乙醚=1：1（V/V）。
【操作方法】 1、 酪蛋白粗品的制备
将100mL牛奶放到500mL的烧杯中，加热到40C，在搅拌下缓慢加入100mL加热到40C 左右的醋酸缓冲液，直至PH到4.7为止，用酸度计调节。将上述悬浮液冷却至室温，离心15分钟（3000转/分）。弃去上清液，得酪蛋白的粗制品。 2、酪蛋白纯品的制备
（1）用水洗涤沉淀三次，离心10分钟（3000转/分），弃去上清夜。其中前两次采用倾倒法清洗，第三次将蒸馏水分别倒入装有酪蛋白粗品的离心管内至刻度或等高，然后用细玻璃棒搅拌，离心10分钟，弃上清夜。
（2）用30mL的乙醇将各离心管内的沉淀搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽虑，除去乙醇溶液再倒入乙醇-乙醚混合液30mL洗涤沉淀两次，抽干后，再倒入乙醚30mL洗涤沉淀两次，抽干，将沉淀从布氏漏斗中移出，摊开在表面皿上风干；得到的便是酪蛋白的纯品。
3、称重，计算含量和得率。
O
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含量：酪蛋白克/100mL牛乳 （克/%）
得率：测得含量/理论含量×100% 式中理论含量为3.5克/100mL。 【思考题】
1、为什么酪蛋白可在等电点时沉淀析出？ 2、蛋白质为什么可以用有机溶剂沉淀？
3、根据酪蛋白的制备方法，请设计一种从血液中提取血红蛋白的方法。 [附] 一、蛋白质分离提纯的一般原则
蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在的，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。把种类如此繁多的蛋白质从组织、细胞中分离出来是一项艰巨的任务。到目前为止还没有一套现成的或一个单独的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序已获得较高纯度的制品，为了使某一特定的蛋白质得到分离提纯，应遵循以下原则：
（一）、前处理：分离提纯某一蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。因此应根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。
1、细胞的破碎 （1）机械法
①组织捣碎法：一般是用高速组织捣碎器，它是一种较激烈的破碎器，虽只允许间断操作（每次几秒 – 30秒左右），但仍会使温度迅速升高，因此要注意保持试剂冷却。这种破碎方法对动植物组织有效。但当破碎酵母及细菌的细胞壁时，应在浓稠的悬浮液中加入适量小玻璃珠以利破壁。
②研磨法：通常使用的是手动或马达驱动的玻璃匀浆器和振动玻璃珠研磨机。有时也用研钵破碎细胞以制备一些细胞器（如线粒体、溶酶体、微粒体等）。对一些难破碎的细胞或微生物菌体，则可加一些研磨剂（如玻璃粉、石英砂、氧化铝、硅胶等）效果更佳。
“细菌磨”则可专用于微生物细胞的破碎，在实验室内使用简单，方便。 （2）物理法
①超声波破碎法：输入高能超声波可以破碎细胞，其机理可能与强声波作用溶液时，气泡产生、长大和破碎的空化现象有关。空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞裂解。
用超声波破碎细胞时，样品浓度有一定限制，其蛋白质含量应低于30mg/mL。连续超声时间长，则样品温度升高，因此通常超声及间隔时间和总的超声次数取决于：在保持样品低
温的前提下，尽可能彻底的将细胞破碎。
②渗透压法 先将细胞置于高渗溶液（如蔗糖溶液获2%氯化钠溶液）中平衡一段时间后，突然将其转入到水溶液或缓冲液中，则细胞壁会因渗透压的突变而破碎，此法适用于处理细胞壁比较脆弱的细胞。
③冷冻干燥法 适于制定不稳定的酶。一般配成10% - 40%细胞悬浮液进行冷冻干燥。经冻干后细胞的渗透性大大变化。
（3） 化学方法
①溶剂处理：丙酮、氯仿、甲苯等脂溶性溶剂，可溶解细胞膜上的脂质化合物，从而使细胞壁结构破坏，一般将细胞制成丙酮干粉后再加提取液，提取细胞内容物。
②表面活性剂处理法：在适当的温度、pH及低离子强度下，表面活性剂能与脂但百姓称微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。此法对膜结合蛋白质的提取有效。但对其它蛋白质易使其变性，甚至切断肽键。
（4）酶解法
组织或细胞破碎后，选择适当的介质（一般用缓冲液）把所要的蛋白质提取出来。 （二）粗分级
当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适用的方法，将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。其常用的分级方法：盐析、等电点、沉淀和有机溶剂分级分离等。这些方法的特点简便，处理量大，既能清除大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。
（三）细分级 （样品的进一步提纯）
样品经粗分级之后，一般体积较小、杂蛋白大部分已被清除，进一步提纯一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层系、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的提纯步骤。用于细提纯的方法一般规模较小，但分辨率高。
（四）结晶
为蛋白质分离提纯的最后步骤。某种蛋白质的数量只有在溶液中占优势时才能形成结晶，而且结晶中从未发现变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是判断制品处于天然状态的有力指标。
※ 实验六
【实验目的】
植物DNA的提取
随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。 【实验目的】
细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。
关于植物总DNA 的提取主要有两种方法： 1． CTAB 法：
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是 一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。 2． SDS 法：
利用高浓度的阴离子去垢剂 SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉 淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，
导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。
几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较低温度下进 行（一般利用液氮或冰浴）。为实现（2）需要在DNA 处于溶解状态时，尽量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行DNA 溶液转移时用大口（或剪口）吸管。提取的DNA 是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点”（melting temperature, Tm）测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用CTAB 法提取DNA 并通过紫外吸收法鉴定。
【实验材料、仪器与试剂】 1．实验材料
新鲜菠菜幼嫩组织、花椰菜花冠或小麦黄化苗等 2．主要仪器
（1）高速冷冻离心机 （2）751 型分光光度计 （3）恒温水浴 （3）冰浴设备 （4）磨口锥形瓶 （5）核酸电泳设备 3．试剂（CTAB 法）
（1）CTAB 提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2，1.4mol/LNaCl（如表1），2% CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的β-巯基乙醇。用HCl 调pH 值。
表1 CTAB提取缓冲液配制