分子生物学实验理论与操作教程
分子生物学实验理论与操作教程
中国农科院研究生院 中国生化及分子生物学学会 植物病虫害生物学国家重点实验室
二零零四年七月
目 录
前 言-----------------------------------------------------------I 第一部分 核酸提取----------------------------------------------1 实验一：基因组DNA提取--------------------------------------------1 实验二：总RNA提取------------------------------------------------3 第二部分 亚克隆技术---------------------------------------------8 实验三：质粒DNA提取----------------------------------------------8 实验四：DNA片段的酶切--------------------------------------------9 实验五：DNA片段的酶修饰-脱磷-------------------------------------12 实验六：DNA片段的连接--------------------------------------------13 实验七： DNA片段的回收-------------------------------------------15 第三部分 PCR技术-----------------------------------------------18 实验八：PCR产物的克隆技术----------------------------------------18 八．1：T-载体构建 ---------------------------------------------19 八．2：PCR产物的T-载体克隆------------------------------------20 八．3：PCR产物的平端克隆技术----------------------------------21实验九：RT-PCR技术-----------------------------------------------21 实验十：定量PCR -------------------------------------------------25 第四部分 文库构建技术------------------------------------------29 实验十一：mRNA的提取及纯化 --------------------------------------29 实验十二：cDNA文库构建技术- cDNA 链的反转合成--------------------32实验十三：1,cDNA文库构建技术- cDNA 链的连接、包装及转染----------34 实验十三：2,RACE技术---------------------------------------------36 第五部分 核酸杂交技术-------------------------------------------40 实验十四：DNA探针的标记------------------------------------------40 实验十五：Southern杂交技术---------------------------------------44 第六部分：基因及基因产物检测技术----------------------------------48 实验十六：DNA的测序技术------------------------------------------48 实验十七：基因表达 1，基因的体外快速翻译-------------------------53 2，基因的诱导表达-----------------------------54 实验十八：报告基因的应用------------------------------------------57 实验十九：Western杂交技术----------------------------------------58 第七部分 基因表达轮廓技术---------------------------------------67 实验二十：DD-PCR技术---------------------------------------------73 实验二一：SSH技术------------------------------------------------74 第八部分：遗传转化技术-------------------------------------------75 实验二二：感受态细胞制备-----------------------------------------75 实验二三：重组基因的转化及筛选------------------------------------77 实验二四：原生质体分离--------------------------------------------78 实验二五：农杆菌转化技术------------------------------------------79 第九部分：分子标记技术--------------------------------------------80 实验二六：RFLP技术-----------------------------------------------86 实验二七：RAPD技术-----------------------------------------------86 实验二八：AFLP技术-----------------------------------------------87 实验二九：SSR技术------------------------------------------------89 第十部分：细胞技术-----------------------------------------------89 实验三十：细胞凋亡------------------------------------------------89 十一：附录 一----------------------------------------------------92 二-----------------------------------------------------96
１
第一部分 核酸提取 目的基因主要可以通过以下途径加以分离获取。对于序列已知或部分已知的寡聚核苷酸基因片断或基因可通过DNA的人工合成直接获取；或利用PCR、RT- PCR及RACE技术，直接扩增出相应的基因片段；对于未知序列的基因或基因片断利用dd-PCR等差异显示技术、转坐子标签技术、分子标记技术、图位克隆及电子杂交等手段分离出相应目的基因或探针片段，建立基因组文库或CDNA文库，再用探针从相应文库中钓相关基因。本部分主要介绍基因组DNA的提取纯化，RNA提取纯化等实验方法，其余内容见相应章节。
实验一:基因组DNA的提取 DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。在DNA提取过程中应做到1,根据不同研究需要，保证结构的相应完整性；2,尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；3,保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。下面结合不同的研究对象列出几种相应的DNA提取方法。
方法1，基因组总DNA的大量提取 本方法通过液氮研磨粉碎动植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在RNA酶作用下，降解RNA，得纯度较高的DNA样品。
一：仪器 高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外观测仪
二：试剂 细胞裂解液（100mM Tris-HCl 5mM EDTA 500mM NaCl 1% SDS pH 7.5）；饱和酚；氯仿/异戊醇；异丙醇；70%及无水乙醇；3M NaAC（pH5.2）；RNA酶；TAE缓冲液；载样缓冲液 三:操作 动植物材料10g(鲜组织) 0.5g(干冻组织) 液氮,研碎
10ml裂解液(含1/10体积酚),(65℃预热),
加入等体积氯仿, 65℃放臵30分钟，
间隔5－10min轻摇一次,
离心(12000-15000rpm, 15min )
上清液
静止下
0.6体积冷异丙醇,
0.1体积3MpH5,2乙酸钠,
挑取絮状体, 70%冷乙醇洗涤,真空干燥, 2mlTE(或水)＋10ulRNase，65℃,10-30分复溶和除RNA 等体积酚/氯仿,氯仿抽提
２
（轻轻混匀、冰浴沉淀5min，5000RPM离心5min，取上清）
上清液
2V无水乙醇、1/10VnaAC, -20,2或-80℃，30min
10000RPM,10min 沉 淀
70%冷乙醇洗涤 真空干燥
干粉-20℃保存，
或复溶于0.5-1mlTE或水中,分装成小体积, -20℃或4℃保存
四：鉴定
所提DNA进行Agarose胶分析（电泳过程见附），紫外观测仪观测，凝胶成像系统拍摄。 注意:
1,裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解 2，酚一定要碱平衡
3,各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解 4,取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰.
5,异丙醇,乙醇.NaAC,KAC等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。
6,本方法适用于以DNA片段的酶切分析、Southern印迹等中，具有快速、省时、省线的特点。
7,此方法也适合菌类基因组DNA的大量提取.
方法二：细菌基因组DNA的微量提取法 本方法通过SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分 一：仪器：同方法一
二：试剂：TE、TAE缓冲液；10%SDS；５ＭNaCL；
20mg/ml蛋白酶Ｋ；CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解)；25/24/1,酚/氯仿/异戊醇; 24/1,氯仿/异戊醇；异丙醇；７０％及100%乙醇
三：操作
1.5ml 对数生长期细菌细胞 离心，5000rpm,1min 沉淀
溶于500μl TE缓冲液中混匀
30μl 10%SDS,3μL蛋白酶Ｋ，混匀，37℃,1小时
３
100μl NaCL(5M) 混匀
80μl的CTAB/NaCL,*混匀；65℃ 10min（可不做） 加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，
离心12000rpm,4-5min
取上清，以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA 、复溶等步骤一致。
注意 １，*此步操作后，离心管中NaCL的浓度不应低于0.5M，否则DNA将与CTAB共沉淀。
2,本法适用于从多糖含量高的样品中提取DNA。对于菌体样品,通过此流程,?可以获得较为完整的DNA分子。
方法三：酵母菌基因组DNA的提取 一：仪器：同方法一
二：试剂：SE缓冲液（1M山梨醇，0.1MEDTA pH7.5）；溶菌酶（50mg/ml）；20％PVP；蛋白酶K缓冲液（10mM Tris pH7.6 0.5% SDS 1mM EDTA）；其余同前 三：操作
1.5ml 对数生长期细菌细胞 离心，12000rpm,1-2min 沉淀
溶于590ulSE缓冲液中混匀+10ul溶菌酶37℃,1hr 离心，12000rpm,8-10min 沉淀
溶于100μL，0.5μl蛋白酶Ｋ，混匀，37℃,1hr
加入1.2ml的CTAB/NaCL,200μl20%PVP 混匀 65℃,30min
等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀, 离心,12000rpm,4-5min
上清,以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA 、复溶等步骤一致。
实验二： 总RNA的提取
完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点，即１）：样品细胞或组织的有效破碎；２），有效地使核蛋白复合体变性；３），对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；5），对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径，1),提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；
４