EcoRⅠ、BstZⅠ、NotⅠ,因此该载体可通过这三类酶进行单酶切构而建重组片断; 而pGEMR-T载体系统的多克隆区两侧都有BstZⅠ酶切序列,因此用此酶进行单酶切操作,即可释放出可插入位点。除了单酶切外,这两类载体都可通过双酶切操作来形成插入位点。pGEMR-T及pGEMR-T Easy载体系统中都有嗜菌体f1的复制起始区,借此可以合成单链DNA。并可用双重反向启动子(T7,SP6)进行体外转录。在 pGEMR-T系列载体系统中,外源片断的克隆将打破载体中的β半乳糖苷酶的编码序列,因此重组子可在指示平板上用颜色反应加以筛选。将外源片断克隆到pGEMR-T载体中,然后再转入感受态细胞,这样在指示平板上蓝白斑的比例将下降,在通常情况小,外源片断的插入将产生白斑,但在某些情况小,含重组子的载体也能形成蓝斑,这主要是插入片断长度(包括3`A突出末端)为3`核苷酸的倍数,且插入位点在lacZ基因的阅读框内,并插入片断不含终止密码子。这样就可能不破坏阅读框而翻译出含β半乳糖苷酶N端多肽片断的融合蛋白,与宿主菌的C端片断发生α-互补而形成蓝斑。有文献报道当重组的外源DNA片断接近2Kb时,其可能会克隆到阅读框,并产生蓝斑。即使实验中预设扩增片断并非3`核苷酸倍数,但扩增过程可能会导致核苷酸突变(缺失突变或点突变),这种片断与 pGEMR-T系列载体重组后,再转化到感受态细胞中后,即有可能产生蓝斑。这点已有文献报道，因此在筛选重组菌斑时要特别注意。
实验八.1：T－载体的构建 一：仪器：同质粒DNA提取实验、酶切实验及RT－PCR实验
二：试剂：SmaI、其余同质粒DNA提取实验、酶切实验及RT－PCR实验 三：操作：
1：提纯载体DNA
2：将1ug提纯的PGEMDNA用SmaI1ul进行全酶切（为了切割彻底、甚至能破坏酶切位点周围碱基序列而防止自连发生，酶可过量使用，并在25℃过夜） 2：酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤，真空干燥复溶 3：在上述酶切反应后复溶的含1ugDNA的Eppendof管中加入 10〓 PCR缓冲液 5 ul 10mM dTTP 10 ul 1mg/ml BSA 10 ul 5U/ul Taq酶 0.5ul 加水至50ul
70℃2小时，酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤，真空干燥复溶 此载体即可直接用于PCR产物的克隆。
实验八.2：PCR产物的T－载体克隆 一：仪器
同连接、转化实验 二：试剂
T－载体，其余同连接、转化实验
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三：操作：
1:PCR产物的纯化见实验八
2：PCR产物的克隆用自制或购臵的T－载体按下述比例进行连接反应
反应体系 阴性对照体系 背景对照体系 10〓T4DNA连接酶缓冲液 1 1 1 T－载体 1 1 1 PCR产物 X(计算见附) 0 0 阴性对照DNA（500bp 4ng/ul ） 0 2 0 T4DNA连接酶（3u/ul） 1 1 1 加水至10ul 3：4℃过夜
4：T－载体与外源片断连接后的转化见实验二二与二三 附：连接反应中PCR产物用量的确定 1：待重组片断与载体间的最佳分子比
T载体与待克隆的对照DNA间的最佳分子比为1:1。一般分子比从1:8到8:1都是适合的。如果在实验开始前,没有确定载体与待克隆片断间的最佳分子比,那么有必要在实验时将最佳比给确定下来。3:1-1:3的比值在大多数情况下都能得到较好的实验结果。PCR扩增后的片断其浓度在实验时也必须确定,确定其浓度的方法为或通过凝胶电泳后对待测片断与一系列成梯度的已知浓度的DNA相比较而确定,或可通过比色法确定。
2：连接反应中待扩增片断的用量可通过下列公式计算 X=A〓B〓D/C a=载体的ng数、b=待克隆片断的碱基数Kb、c=载体碱基数Kb d=待克隆片断与载体分子比（根据附1确定）、x=连接反应中待扩增片断的用量 3用pGEMR-T系列载体系统生成单链DNA方法 要诱导单链DNA的生成,应用特定的辅助嗜菌体去感染含pGEMR-T或
pGEMR-T Easy载体的菌体。质粒进入f1嗜菌体的复制区,使得单链DNA象存在于包装蛋白内的病毒颗粒一样被分泌出来。这种单链DNA很容易通过沉淀和抽提方法加以提取和纯化。
注：1：在室温下,缩短保温时间,也可能是有效的操作方法,但这有可能降低克隆数。最适的连接条件为4℃过夜，因PCR产物与T－载体间的配对碱基少，高温不利于连接的进行。经验表明如连接反应高于15℃，则兰斑数大大升高，可能T载体中存在没有加上T的载体，高温下平端自连的比例增加。 2：连接酶最好用相关的经修饰纯化的T4DNA连接酶,因其他连接酶可能具核酸外切酶的活性,这样如用这种酶就有可能导致对载体3’T产生切割。
3：T4DAN连接酶的10〓缓冲液中含ATP,在温度频繁波动时,此成分有可能被降解,因此要避免仅为了少量使用而对缓冲液反复冻融。如果在融化后的
T4DAN连接酶10〓缓冲液中出现沉淀,则应将此缓冲液振荡,以使沉淀复融。 4：重组T载体转化时最好用SOC培养基,LB培养基也能用,但转化数可能低。
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5：因含β半乳糖苷酶的菌落生长速度慢于无此酶活的菌落,因此保温过夜后,蓝斑菌落要远小于白斑菌落,白斑菌落的直径近1毫米。
实验八.3：PCR产物的平端克隆 仪器：同上
试剂：SauI,Klenow片段,T4连接酶
操作：载体提取后用过量SmaI切割，提取、纯化
PCR反应液加热到99℃10 min，灭活Taq酶，补镁离子到5-10mM加入1u Klenow片段，70℃15min。纯化
载体与PCR产物以1：10比例16℃连接过夜
PCR反应液可直接用于连接，但最好对PCR产物纯化后进行连接，既能去掉dNTP与ATP竞争连接酶又能浓缩PCR产物。
实验九:RT-PCR技术 目前已有多种方法用来研究有关细胞和组织中，基因表达产物方面的内容，这些方法主要有Northern印迹、RNase保护分析法、原位杂交、点印迹、Ｓ１核酸酶分析法及反转录与PCR扩增串联的RT-PCR技术等。在这些方法中RT-PCR技术具敏感度高和应用范围广的特点，该技术提供给研究人员有效的进行测定转录产物存在与否、评估基因表达水平等方面的工作,并在不需要构建和筛选cDNA文库的前提下，完成对cDNA片段的克隆。利用RT－PCR技术分离目的基因是目前基因操作中最有效的途径，RT－PCR扩增产物经纯化、回收、与载体重组克窿，即可实现基因的分离。
RT-PCR可由总RNA或mRNA作为模板，该技术目前有多种操作方法 一:两步法：
(一)MMLV、MuLV(莫洛尼鼠反转录酶)，AMV(鸟成骨髓细胞性白血病毒反转录酶)/Ｔaq酶系统:在此系统中，先有反转录酶合成cDNA第一条链,随后灭活反转录酶,有Taq?酶合成cDNA第二条链和进行PCR扩增。
(二)TthDNA聚合酶/Mn,Mg离子系统。在此系统中，TthDNA?聚合酶在不同离子缓冲液中表现为不同酶性质，在Mn离子缓冲液中，该酶表现为反转录酶性质，而在Mg离子缓冲液中又表现为聚合酶性质。因此操作中，先使系统处于Mn离子状态，有TthDNA酶反转录出cDNA第一条链，随后加入EGTA[乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸]鏊合Mn(因Mn?的存在将抑制TthDNA 酶的聚合酶性质的发挥)，再将系统调整到Mg离子状态，有TthDNA酶合成cDNA第二条链及PCR扩增。
二：一步法：
(一)TthDNA聚合酶/Ｎ－二(羟乙基)甘氨酸系统。在此系统中，Ｎ－二(羟乙基)甘氨酸的存在时，Mn离子将不具有抑制聚合酶的聚合活性，因此该酶不需用在中途添加任何试剂到反应系统中，而完成cDNA第一条链－cDNA第二条链－PCR扩增的全过程，但Mn离子的存在虽不会抑制聚合酶活性，且会降低核苷酸渗入的忠实性，因此在要求高度忠实性的实验中,不主张使用该系统。 (二)AMV/Tfl系统。在此系统中cDNA的第一条链的合成有AMV反转录而成，
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而cDNA第二链的合成及随后的PCR则有Tfl聚合酶催化而成。
下面我们就分别介绍二步法中的MMLV/Taq系统及一步法中的AMV/Tfl?系统的详细操作过程。
MMLV/Taq系统进行RT-PCR（二步法） 一：仪器 PCR仪、离心机、取液器、电泳仪 、电泳槽 、紫外观测仪 二：试剂 PCR试剂、Taq酶、dNTP、DDT、RNA酶抑制剂
10〓缓冲液 500 mM KCL 100 mM Tris-HCL (pH 8.3 室温) 15 mM MgCL 0.1% 明胶 三：操作
１：总RNA及mRNA的提取见实验二，十一 ２：cDNA第一条链的合成
（1）变性及褪火
（m）RNA 1-2μg 特异引物(100μg/ml) １μl 补水至10ul
90℃ 1min，50℃ 5min,冰浴
（2）：上述管中按下表加入各反应成分 １０〓扩增缓冲液 ２μl ４种dNTP混合液 ２μl 50mM MgCL2 1μl DTT 1ul
RNA酶抑制剂 ２０单位 MMLV 200单位 加水至 20μl （2）：３７－42℃反应３０分钟
（3）：于９５℃ 加热５分钟，灭活反转录酶 3：PCR扩增
按下表加入：
１0〓扩增缓冲液 5ul dNTP 2ul
上游寡核苷酸引物 10-50pmol 下游寡核苷酸引物 10-50pmol Taq聚合酶 2.5u 加上至总体积 50μl 加矿物油 50μl 4：设定参数，PCR扩增 AMV/Tfl系统（一步法）
在本系统中一个反应管、二种酶系统为分析RNA尤其是衡量RNA提供了灵敏度高、快捷便利、可重复性强的方法。由AMV催化cDNA第一链的反转合
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成;Tfl催化合成cDNA的第二链及进行PCR的扩增反应。该系统提供单一的反应缓冲液体系,而不需要在RNA反转和PCR扩增之间添加其他缓冲液。这样既简化了操作步骤,又降低了RNA模板被污染的可能性。另外该系统的操作
中,AMV的反转温度为48℃,这又在最大程度上防止了RNA二级结构的形成。 一:仪器：同上 二：试剂： 1：同上
2：Access RT-PCR试剂盒 三：操作
１：反转录反应
按下表准备反应液
样品 体积 终浓度 ５〓反应缓冲液 10μl １〓 dNTP混合液 1μl 0.2mM 下游引物 50pmol* 1μm 上游引物 50pmol* 1μm 25mM MgSO4 2μL 1mM
AMV反转录酶 1μl 0.1μ/μl TflDNA聚合酶 1μl 0.1μ/μl RNA模板 xμl**
去核酶无菌水 加至５０μl ２：滴加１－２滴去核酶的矿物油
３：在控温水浴或其它设备中48℃保温４５分钟
４：设定PCR参数，PCR循环以合成cDNA第二链及扩增 ５：RT-PCR产物分析
反应产物上１％的琼脂糖凝胶电泳分析结果，对于对照样品，扩增条带为323bp。
６：扩增产物在－20℃保存。
注1：引物，５０pmol＝16.3ng〓b,b:引物碱基数。对于对照样品上下游引物钧取3.3μl；模板，用103－106拷贝量的模板，或1pg-1μg总RNA，对于对照反应，选用对照模板量为2μl(106拷贝量)
2：RT-PCR能否有效地进行,依赖于模板mRNA的完整性和纯度。在操作中必须具备一个无RNA-酶的环境,实验过程中应该用消毒的离心管、吸液头,戴手套,用DEPC处理的水。如果要从核酸酶活性高的样品中分离RNA时,建议使用RNA酶抑制剂。
3：在使用此RT-PCR系统时,为了获得精确的实验结果,要求作模板的RNA,不管是总RNA、mRNA、还是合成的RNA,都要是无DNA的样品。系统中TflDNA聚合酶在系统规定的操作条件下,无反转酶活性,但是如果反应体系中含与模板有同样序列的微量DNA,则该酶会催化扩增出非实验所需的片断。
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