加水至 30μl b: 15℃保温6-18小时
c:70℃加热10分钟后放臵于冰浴 2:磷酸化反应
a:按下表准备反应体系
上述1.a反应物 30μl T4磷酸激酶10〓缓冲液 4μl 0.1mM ATP 2μl T4激酶(10μ/μl) 1μl 水 3μl 总体积 40μl
b:37℃保温30分钟。用DNA纯化柱纯化带接头的cDNA
c: 用1ml Sephacryl S-400装柱，TEN缓冲液平衡拄，平衡液流干后，加套管，800g5min
d: 上样,用1mlTEN缓冲液洗柱2次,收集洗脱液。洗脱时加套管，800g5min e：合并洗脱液.
D：3M NaAC和无水乙醇沉淀，干燥复溶 3:cDNA与载体联接：
a:准备4个离心管,按下表加入
A B C D 载体DNA0.5ug/ul) 2
cDNA(10ng/ul) 0 3 2 1 10〓T4DNA连接酶缓冲液 1
水 6 3 4 5 T4DNA连接酶 1 b:保温，室温:3小时;4℃过夜 4:体外包装：
a：从－７０℃取出包装蛋白，冰浴中溶化，每管50ul
b：包装蛋白混合液完全溶化后，立即加入10ul“3.a”中的连接液，轻弹管壁，轻轻混匀。
c：22℃（室温）放臵3小时
d：上述包装混合液中加入445ul的phage缓冲液和25ul氯仿，轻轻混匀，冰浴保存。（包装液4℃下可存放7天） 5：感染
a：灭菌培养皿中倒入下层LB培养基，凝固后，37℃保温 b；安1：1000的比例稀释“4”中的包装混合液。 c：取100ul稀释液和100ul菌株（Y1090、LE392）
d：取4ml熔化45℃保温的上层培养基加入到“c”中的混合液中，混匀后铺板在37℃预热的下层培养基上，37℃过夜。
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6：收集和扩增文库
构建的cDNA文库经扩增后，才能保存和进行长期筛选。本文库由λgt11作为载体而构成，因此扩增时应在大肠杆菌Y1090中进行。
a：在过夜后的培养皿上挑取出现的噬菌斑，加2－3mlSM缓冲液，室温震荡２小时。４℃7000g离心30min,以除去细胞碎片，分装上清，溶解噬菌斑，4℃8000－10000g快速离心10min，以除去细胞碎片和培养基成分。 b：重复上步操作
c：上清液转入一新管 中，如要在4℃短期保存则按１ml上清中加入20-30μl的比例加入氯仿，4℃保存；如要长期保存则应加入终浓度为７％的二甲基亚砜，于－70℃保存。以被需要时重新涂板筛选文库。?。
总结：C文库构建的简单流程为： RNA－mRNA－cDNA单一链的合成－cDNA单二链的合成－加接头－与载体连接－体外包装－转染－筛选文库（实验二－实验十一－实验十二－ 实验十三－1）
实验十三-2:RACE(Rapid Amplification of mRNA Ends by PCR)
技术扩增构建全长cDNA文库
上面介绍的cDNA文库构建技术,是一种经典技术。但由于1，在以mRNA模板进行逆转录过程中，逆转录酶在从模板mRNA中逆转录酶脱落，只能得到部分拷贝的cDNA产物；2，mRNA极易降解，而在进行逆转录过程中，这些5'末端部分被降解的mRNA仍可为模板合成cDNA，因此用此方法构建的文库在多数情况下其5'末端为部分缺失的cDNA。另外传统C库构建时需要在合成的cDNA双链两端加上adaptor，连接效率较低,上述原因往往导致低丰度或者是较长的cDNA信息的丢失，使文库偏重高丰度和较短的基因，失去应有的代表性。而好的cDNA克隆应包含模板mRNA的5'帽的结构以及3'多聚A尾的全长序列,并包含低丰度的基因信息。至于利用检测特异表达产物如抗体技术等进行筛库时,要求C库为表达文库，而传统建库技术在构建表达文库时,能得到的正确表达信息很低,这是因为1,加接头时是在cDNA的两端同时进行,因此无法保证cDNA插入载体时,不出现反向插入，而反向接入载体的那些cDNA不能正确表达，因而有50%的可能丢失。2,表达时3个碱基代表一个氨基酸，不同的表达框架会得到不同的产物，因此正向插入一个表达载体的cDNA只有1/3的可能得到正确的产物。虽然一度有ABC表达载体的解决方法，但是一段DNA同时插入3个载体的机会是有限的。
利用RACE(利用PCR技术快速扩增全长mRNA)技术构建全长cDNA文库是传统C库构建技术的改进。其原理是利用真核mRNA的3’poly(A)和5’帽子结构作为标签，用通用引物识别并配对标签序列，PCR扩增后克隆PCR产物，从而构建出全长并有正确阅读框架的C库。
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RACE技术最早是cDNA水平上加接头，以扩增未知5’序列。而随着技术的进展，目前RACE技术已发展到直接以mRNA为模板进行操作，这就保证了全长cDNA的克隆，为研究5’和3’非编码区及启动子提供了条件。
RACE分3’RACE和5’RACE。3’RACE原理如图13－3－1。其用带olig(dt)和特异酶切位点的序列为3’引物；用特异序列为5’引物，经RT－PCR后，扩增出3’全长序列，利用特异酶切位点，插入载体。
5’RACE分两种，其一为SMART（Mechanism At 5' end of the RNA Transcript）技术，其原理为在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）或特异3’序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后扩增。由于有5'帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA其5’端为完整序列。其二为寡核苷酸帽法(Oligo capping method)。其原理如图13－3－2。具体为利用CIAP脱磷，而全长mRNA由于有帽子结构，不被CIAP作用，这样非mRNA及无帽子结构的5’不完整mRNA5’端为OH结构。然后用TAP（烟草酸性焦磷酸化酶，tobacco acid pyrophosphatase）焦磷酸化帽子结构，使5’完整的mRNA在5’端带磷酸基团。用RNA连接酶将无磷酸化的adapt连接到5’末端，3’引物RT后，adapt配对序列扩增，这时由于只有5’完整mRNA才有接头序列，因此扩增的结果只能是扩增出5’完整的mRNA。在此过程中PCR的放大作用，使低丰度的基因也能被信号放大。利用RACE技术构建全长cDNA文库，是综合利用3’和5’RACE，3’RACE引物选择poly(A)，5’RACE引物选择帽子结构，这样使得扩增产物为带有5’、3’非编码区、起始密码、中止密码的完整cDNA。利用RACE技术建库时，模板RNA可为总RNA或mRNA，但要扩增低丰度样品，以纯化的mRNA为模板为好。模板用量一般为总RNA1-5ug;mRNA为50-250ng。
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图13－2－1：3’RACE原理图
本实验即是利用寡核苷酸帽法，进行全长C库的构建，从而掌握RACE技术的原理与基本操作方法。 一：仪器：同实验12，13－1
二：试剂：RACE试剂盒（invitrogen），其余同实验12，13－1
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图13－2－2：5’RACE法的原理图
三：操作
1：RNA、mRNA提取见实验2、12 2：mRNA5’端加接头
1)：脱磷酸化 A：按次序加入下述试剂
RNA/mRNA Xul(RNA1-5ug,mRNA50-250ng)
10×CIP buffer 1ul RNase inhibit(40u/ul) 1ul CIP(10u/ul) 1ul
加DEPC水到10ul B：混匀后50℃1hr, 轻微离心，臵于冰浴。 C：沉淀mRNA
a:上述反应管中加入90ulDEPCH2O，用酚/氯仿抽提
b: 1/10体积，3MpH5.2乙酸钠、2体积乙醇沉淀，70％乙醇洗沉淀 c:干燥后溶于7ulDEPC水中
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