制备的质粒既可以满足内切酶图的绘制、细菌转化、特定DNA片段的分离、常规亚克隆及探针标记等方面的工作需要。在质粒DNA提取中，质粒DNA的质量和产量在很大程度上受培养条件的影响,通过一些实验发现,下列培养方式能获得较好的结果：
1培养应用菌龄不超过4天的平板单菌落作为起始菌 2培养菌应在37℃,220rpm下,生长16-18小时 3不能用经储藏的培养菌直接进行质粒提取制备。 下面介绍几种质粒DNA提取的方法：
方法一: 碱解法提取质粒DNA
－本方法适合于质粒DNA的微量提取
一：仪器
超净工作台、超级恒温器或恒温水浴、台式离心机、培养箱、取液器、摇床、冷冻真空干燥器、低温冰箱或冰柜、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪 二：试剂 １：Solution Ⅰ 50mM 葡萄糖,
25mM Tris-HCl(pH 8.0)
10mM EDTA(pH 8.0), 高压灭菌，4℃保存 ２：Solution II 0.2M NaOH, 1% SDS, 现配现用
３：Solution III 5M KAC 60ml,11.5冰乙酸，28.5水，4℃保存 ４：3M NaAC pH 5.2 高压灭菌，4℃保存 ５：氨苄青霉素 50mg/ml, ６：溶菌酶
７：酚/氯仿/异戊醇(25/24/1) ８：异丙醇 ９：LB培养基 10:电泳试剂见附 11:TE缓冲液 三：操作步骤
含氨卞（100ug/ml）的LB培养基 培养菌体 37℃ 200rpm 过夜 │ 吸取1.5ml
离心，5000rpm,1min
沉淀
( 充分去除LB培养液)
加入预冷的100ul Solution Ⅰ,充分振荡悬浮 加入200ulSolutionII,颠倒徭匀后冰浴中3-5min, 加入150ul预冷Solution III混匀, 冰浴5min 离心,12000g,5min 取上清
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酚/氯仿/异戊醇、氯仿各一次，离心 5000g 5min
上清
0.6体积的异丙醇,室温,5min, 离心,12000g,,5min 沉淀 冷冻干燥
悬于50μldd水或TE
RNA酶至20ng/ul37-65℃，30-60分钟(可不做)
酚/氯仿、氯仿抽提、乙醇沉淀（-70℃，15min/-20℃,2 hr） 离心 10000g，5-10min
沉淀― 冻干―――― 复溶
-20℃保存───┴───电泳鉴定
注１：试剂中所用葡萄糖有增加粘度，降低剪切率，减少DNA的降解
２：试剂中所用EDTA有抑制DNase的作用，还能降低离子浓度，而高浓度离子对溶菌酶有抑制作用。
３：试剂中所用NaOH能使DNA变性，KAC能使DNA复性，并有助于蛋白等其它大分子成分沉淀。
4：如A,不用酚/氯仿抽提;B,LB培养基残留；C，提取中在溶液II中时间过长，导致共价闭合环状DNA不可逆变性，则可能影响酶切。
质粒提取方法还有很多，如要进行重组质粒的植物转化或质粒测序则应进行氯化铯梯度离心，或直接采用试剂盒提取。
另试剂盒提取可同时进行许多质粒的提取，能在最短时间内获取高质量、高浓度的质粒DNA
如果要提取大质粒DNA则建议使用溶菌酶裂解细胞，以释放质粒DNA
实验四： DNA片断的酶切技术 限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶,这类酶的发现和应用促进了以DNA重组为基础的生物工程技术的迅猛发展。该类酶是体外剪切基因片段的重要工具，基因物理图谱的绘制、核苷酸序列的测定、基因片段的重组，重组子的筛选、探针的制备及各种杂交、测量基因的拷贝数,基因文库构建,分子标记等都离不开限制性内切酶的应用。另外以限制性内切酶为基础的各种限制性内切酶片段长度多态性分析，促进了分子遗传学、分类学等相关学科的应用和发展。可以这么说，没有限制性内切酶的发现和应用就没有现代意义上的分子生物学、分子遗传学，也就不会有任何基因工程产品。而对于从事分子生物学或相关领域研究工作的人员讲来，如果不能很好地了解和掌握内切酶技术，那就根本不可能开展这方面的任何工作。
本部分实验主要通过EcoRⅠ，Hind III两种限制性内切酶对λDNA的单酶切、双酶切及部分酶切的操作，使学员能掌握内切酶的实验操作技术 一：仪器： 离心机 、 恒温水浴 、取液器、 电泳仪 、电泳槽、 紫外观测仪 二：试剂
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EcoRⅠ,Hind Ⅲ,λDNA/HindⅢ及λDNA/EcoRⅠ 标准 质粒（或其他DNA样品）（浓度> 0.5μg/μl） TAE缓冲液 三：操作
(一)EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ单酶切及双酶切
1, 取２支干净、灭菌新Eppendof管，分别按下表加入 Ａ(μl) B(μl)
灭菌水 １3 １3 EcoR Ⅰ缓冲液 ２
Hind Ⅲ缓冲液 ２ λDNA （或质粒DNA ） 4 4 EcoR Ⅰ １
Hind Ⅲ １ 总体积 ２０ ２０ ２，37℃保温１－4小时
3，保温结束后65-70℃10min灭活酶(如为热稳定性酶,则用氯仿抽提) 4，取2μl左右的反应液加入2μl电泳加样缓冲液，电泳 （二）EcoR Ⅰ、Hind III双酶切
1,取一支干净、灭菌Eppendof管，按下表加入各种试剂 加入试剂 体积（μl） 灭菌水 1２ MULT buffer 2 λDNA（或质粒DNA） 4 EcoR Ⅰ １ Hind Ⅲ １ 总体积 2０ ２，37℃保温１－２小时
３，保温结束后65-70℃10min灭活酶(如为热稳定性酶,则用氯仿抽提) ４，取2μl左右的反应液加入2μl电泳加样缓冲液，电泳
注意：１，样品加入次序为水、缓冲液、DNA最后为酶，不应颠倒， ２，加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA混匀
３，反应体积中水的量要尽量少，即反应体系的体积要尽量少，一般水解0.2-1ug模板DNA时，应将体积控制在20－30ul内。但要保证所加酶的体积不高于总体积的1/10,因为限制性内切酶是保存于50%甘油中的，如加酶体积高于总体积的1/10,则反应液中甘油浓度将大于５％，而此浓度将抑制内切酶活性。
4，为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板DNA的浓度应很高，否则反应体系中DNA浓度太低则将引起酶反应动力学改变、降低酶解效果，此时不得不增加反应体积；而一般为了增加DNA储藏的稳定性，DNA多保存在TE
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缓冲液中，如反应体系中过多加入模板DNA溶液则势必造成反应体系中EDTA浓度升高，而对酶产生抑制。因此如底物DNA浓度过低则应进行浓缩。 5，本实验中双酶切时，因两种酶的缓冲液盐浓度要求相同，所以，可在同一反应体系中完成双酶切。但如进行双酶切时，两种酶所需缓冲液盐浓度要求不同，则不能将两种酶同时加入同一体系，进行反应，此时可采取下列处理办法
a:先用在低离子强度的缓冲液中活性最高的酶切割DNA，然后加入适量的NaCL及第二种酶，继续保温。
b:使用所有限制酶均可作用的单种缓冲液(谷氨酸钾缓冲液)。
C:一种酶水解完后，进行有机溶剂抽提，沉淀、干燥后再复溶然后进行第二种酶切。
在上述3种方法中遇到最多的可能为C
6，在水解结束灭活酶时可采用65℃加热10分钟或加EDTA至终浓度10mM，二者各有利弊，加热简单但对有些酶灭活不彻底。EDTA对酶的灭活彻底，但EDTA存在将使连接反应变得极为困难，因此在连接前要求重新用有机溶剂抽提，这将增加操作难度和导致DNA的损失。
有关DNA限制性内切酶使用中的一些其他问题可参见附录。
实验五:酶切片断的脱磷技术 在对DNA片段的修饰中，脱磷酸化反应是一个重要内容,该反应有碱性磷酸化酶催化，该酶可使线状DNA上去除5'磷酸基团，而DNA的脱5'磷酸基团是基因重组、载体构建中防止载体DNA自身联接、环化的重要途径，载体经单酶切线性化后,3’端为羟基、5’端为磷酸基，在连接酶作用下将以极大比例发生载体自连,而5’脱磷后,载体在5’与3’位均为羟基不能自连只有与带5’磷酸基的外源片断连接,载体与外源片断间形成一个磷酸二脂键和一个缺口,缺口在转移进细胞后修复.另外脱磷作用还可发生在RNA、DNA、三磷酸腺苷、脱氧三磷酸腺苷的5’端，这个反应是进行探针标记操作中的重要环节。 一：仪器 离心机 恒温设备 真空干燥机 取液器 二：试剂
碱性磷酸酶、λDNA酶切片段、酚、氯仿、0.5M EDTA(pH 8.0) 、SDS、 TE缓冲液、电泳缓冲液、7.5M NH4AC(pH 7.5) １０〓碱性磷酸酶缓冲液： 10mM ZnCL 10mM MgCL
100mM Tris-HCL(pH 9.0) 三：操作 １：在实验四所得DNA限制性内切酶片段中加入
10〓碱性磷酸酶缓冲液 10μl 碱性磷酸酶(0.01u/pmol ends) 1-2ul ddH2O 到 100ul
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对于5’突出则37℃下温浴30分钟,再加入1ulCIAP(0.01u/pmol ends), 37℃下温浴30分钟.
对于平末端或3’突出末端,则37℃下温浴15分钟,56℃下温浴15分钟, 再加入1ul CIAP(0.01u/pmol ends), 37℃下温浴15分钟. 56℃下温浴15分钟 ２：温浴结束后加入EDTA(pH 8.0)至终浓度分别为10mM，65℃加热20min，以灭活碱性磷酸酶 ３：用酚、氯仿各抽提一次
４：加入1/2体积NH4AC，充分混匀，再加入２体积的乙醇，－20℃放臵2hr（或－70℃30分钟），12000g离心10分钟，沉淀DNA。 ５：冷70%乙醇洗沉淀一次
６：TE溶解（终浓度为100μg/μl），-20℃保存 四:检测 将脱磷片断中加入连接酶,以加入连接酶的非脱磷片断作为对照,,连接反应后,Agarose电泳分析,脱磷片断不能连接,而非脱磷对照片断能连. 注：1, pmol ends=3.04〓ugDNA/DNA的碱基数
2，在上述几个实验中，有机溶剂沉淀时所用NaAC的pH最好为7.2或用7.5M的NH4AC，如用pH5.2的溶液则有可能导致EDTA沉淀量增加，影响以后的连接反应。
3,碱性磷酸酶有两类BAP（细菌碱性磷酸酶）和CIP（小牛肠道碱性磷酸
酶），因BAP耐热，灭活时必须采用有机溶剂抽提法，而CIP在68℃10％SDS条件下级可灭活，因此实验中一般都采用CIP。
实验六: 基因的重组连接技术 DNA酶切片段的连接是分子生物学实验中又一关键技术，该技术是基因重组，基因改造的重要中间环节。两DNA片段相邻的5'磷酸和3'羟基间可由连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA联接酶和T4DNA联接酶催化，但分子生物学实验中主要采用T4DNA联接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。在分子生物学实验中连接酶主要用于1)基因重组中载体与外源基因的连接；2) 接头与DNA片断的连接，这种连接一般发生在文库构建、分子标记的AFLP及差异表达的研究等中。连接反应可在溶液中进行也可在琼脂块中进行。本课程中在AFLP、文库构建、PCR片断的克隆等中均有连接的内容，在本部分仅以重组克隆为目的介绍相应的连接类型。在基因重组克隆中外源DNA与载体的连接是承上启下的一步操作，根据连接片断末端类型不同，连接方式有粘端连接、平端连接等和平粘端连接及单碱基配对的T－载体连接。其中粘端连接的效率最高，粘端连接与平粘连接中外源DNA片断在载体中的插入有方向性。平端连接的效率最低，且载体发生自连的比例较高，因此在克隆操作中为了克服平连的弊端，通常可通过1)TdT酶在载体和外源DNA片断上转移一互补序列（核苷酸投影法）；2)在载体和外源DNA片断上加上人工接头，变平连为粘连。下面拟通过T4DNA联接酶对酶切片段的连接
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