的强免疫作用及稀土元素磁铁与顺磁性物质间的强磁性作用。mRNA的磁珠分离技术提取mRNA的原理主要为用生物素标记的Oligo(dT)与mRNA3'端的poly A退火形成杂交体，然后用带有亲和素(链菌素抗生物素)的顺磁磁珠洗涤并捕获杂交体，形成杂交体－磁珠复合体，最后用磁架将此复合体捕获，这样mRNA即可与其它形式的RNA相分开，进一步用无RNase无菌水洗涤，即可获得纯化的mRNA。
方法一:磁珠法提纯mRNA
一：仪器 水浴 离心机 取液器 分光光度计 二：试剂 mRNA 分离系统试剂盒, 异丙醇， 3MNaAC 三:磁珠法分离mRNA的原理图示如下：
四：操作
（一 ）生物素标记的Oligo(dT)探针与mRNA的煺火
１：在DEPC处理过的1.5mlEppendof管中，加入0.2-1mg的总RNA和无RNase的水至终体积为0.5ml。 ２：65℃加热10min
３：加入2μl生物素标记的Oligo(dT)探针和12μl的20〓SSC于RNA中轻轻混匀，室温放臵，逐渐冷却平衡至室温，此步操作一般需10min。 （二）亲和素顺磁磁珠（SA-PMPS）的冲洗
4：将SA-PMPS轻晃开后，放入磁性分离架中，使SA-PMPS集中于试管一则(约30秒)， 小心去除上清（不用离心方法）用1.5ml0.5〓SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分离架集中磁珠， 去除上清，漂洗３次。
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5：将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2ml0.5〓SSC中。 杂交体的生成及漂洗
6：将上步\３\中褪火的生物素标记的Oligo(dT)探针，全部加到上步\管中,轻轻混匀，室温放臵10min。每隔2分钟轻轻混匀一次 7：用磁性分离架捕获磁珠，吸弃上清。
8：用0.3ml0.1〓SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分离架集中磁珠，吸弃上清，漂洗4次。
（三）洗涤收集mRNA
9：将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2mlDEPC水中。
１0：用磁性分离架捕获磁珠，将洗脱的水相吸至一新管中。重复洗涤一次，吸取水相，两次水相合并(约0.25ml)
１1：在洗脱液中加入0.1体积的NaAC,1体积的异丙醇，－２０℃沉淀过夜，12000g 离心10min,75%乙醇洗沉淀，真空干燥。
１2：提取mRNA质量的分光光度计检测，将所提mRAN分别在260,280nm比色，要求A：OD260％/ OD280％不小于2.0及40μg所提样品在OD260％的值为1 .
１3:提取mRNA质量的电泳检测，在1%的变性胶上，EB染色后，mRNA应在0.5-8Kb间均匀着色，1.5-2Kb间着色较强。 方法二:亲和柱层析法提纯mRNA
该方法利用mRNA上的寡聚A可与较联寡聚T的纤维素柱在高盐下以碱基配对形式发生亲和吸附，而在低盐下，碱基配对能力破坏，吸附解除，而其他成分的RNA则不具该特性，因此在高盐下当RNA抽提样品流经该柱时，mRNA被挂在柱上，而其他RNA则随高盐溶液流出；当用低盐洗脱液洗柱时，mRNA随洗脱液流出。再用有机溶剂沉淀则可得纯化mRNA。 一：仪器，层析系统，其他同方法一 二：试剂，
柱材Oliga(dT）－纤维素
上样液：20mM Tris-HCL(pH 7.6) 0.5M NaCL
1mM EDTA (pH 8.0)
0.1% 十二烷基肌氨酸钠（SLS） 洗脱液：10mM Tris-HCL(pH 7.6) 1mM EDTA (pH 8.0) 0.05% SDS 三：操作
1：DEPC处理层析柱
2：0.1M NaOH处理Oliga(dT）－纤维素 3：用1〓上样液洗柱至pH< 8.0
4: 无菌水溶解RNA，65℃温浴5分钟后，迅速冷却至室温，加等体积2
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〓上样液，上样，分部收集。
5：1倍体积1〓上样液洗柱，分部收集。
6：OD260沉淀收集液，确定收集液的该值是否接近0，如该值仍很大，则上样液继续洗柱，直至该值接近0。
7：2－3倍柱床体积的洗脱液，洗柱，分部收集。 8：测定各收集管的OD260，将有吸光值的各管合并。 9：进行方法一的“11－13”步。
实验十二:cDNA文库构建技术-cDNA链的反转合成 构建cDNA文库是一种获得目标基因并进一步进行基因重组,基因克隆的重要方法,而在该文库构建中有mRNA 逆转录出cDNA是一步极为关键的操作。mRNA的逆转录主要由MMLV、AMV两种逆转录酶催化合成cDNA，在这个逆转录过程中，模板mRAN及逆转录酶是两个最重要的影响因素。对于mRNA来讲，一是丰度，二是纯度，丰度愈高，纯度越好，合成效率越好。在逆转录酶作用下，以Oligo(dT)或寡聚６核苷酸(随机)为引物，进行cDNA第一链的合成。而第二链的合成有自身引物合成,外加引物合成及臵换合成,本实验采用臵换合成法进行,即在RNaseH作用下，部分降解RNA，再用DNA多聚酶Ⅰ产生的DNA片段取代，以合成第二条链。
一：仪器：恒温水浴,离心机、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪
二：试剂： cDNA合成试剂盒、饱和酚、氯仿/异丙醇、EDTA、乙醇、3M NaAC pH 5.2、TE缓冲液 三：操作
１：第一链的合成：
a:在灭菌的DEPC处理Eppondef管中,分别加入: 模板 样品mRNA 1μg
引物 (0.5μg/μl) 1μl （6碱基随机引物 或oligdt） 加水至 10μl b:70℃5-10分钟,冰浴冷却5分钟
c:在上管中，根据下表依次序分别加入 5〓第一链缓冲液 4μl 核酶抑制剂 40μ 40mM焦磷酸钠 2μl AMV反转录酶 20 μ 加水至 20μl d:敲打混合,离心后放于37℃或42℃60分钟。
e:反应完毕后,将反应管臵于冰浴。用于第二链合成。
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注：引物可为特异引物（构建特异文库）、olig0(dt)15引物或6核苷酸随机引物，但不同引物RT时温度不同，前两种在42℃下进行，而随机引物则在37℃下进行。 ２：第二链的合成
a:第一链合成完毕后，直接进行第二链的合成。在第一链合成体系中分别加入 2.5〓第二链缓冲液 40μl， DNA聚合酶Ⅰ 23μ RNase H 0.8μ 加水至 100μl
b: 14-１６℃下放臵2小时。(>3Kb时反应时间延长至3-4小时) c：70℃，10min，点动离心,臵于冰浴
d: 在样品管中加入T4DNA聚合酶2μ,37放臵１0分钟。 e：加入 4μl 500mM的EDTA到该样品管中,然后臵于冰浴上. f: 等体积加入酚\\氯仿\\异戊醇抽上清,12000g，3min。
g: 上清液转移至一干净试管,加2V乙醇,1/10V乙酸钠，-20℃30min沉淀,12000g，15min收集沉淀，70%乙醇洗沉淀,干燥,TE复溶。
合成后的cDNA链既可经与一定的通用接头连接后,生成末端序列,也可通过一定的内切酶处理,形成一定序列的末端片断,然后（1）与未端有互补序列的λ臂-DNA连接，形成重组λ-DNA,再经体外包装形成完整λ噬菌体，经转染后,生成噬菌体cDNA文库.（2）与未端有互补序列的质粒载体连接，形成重组质粒DNA, 生成质粒cDNA文库。目前经常使用的一些载体已经商品化,商品化的λ载体主要有噬菌体左右臂、复制原点及启动序列构成,其在连接酶作用下,可直接于具相同末端序列的cDNA互补连接。cDNA末端序列的产生可通过1)可添加核苷酸后酶切；2)直接加商品接头而形成与相应噬菌体左右臂相互补的序列。不同载体有不同的末端序列,有不同的宿主菌,有不同的筛选方式,因此在进行文库包装时,一定要搞清楚这些情况,以有的放矢的进行工作.
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cDNA合成模式图
cDNA文库构建流程
实验十三-1：cDNA链的连接、包装及转染 一：仪器:同实验十二
二：试剂:EcoRⅠ连接子试剂盒 三：操作: 1:cDNA加接头反应 a:按下表准备反应体系
10〓缓冲液T4DNA连接酶 3μl BSA 3μl cDNA 2.5μl 连接子 1μl T4DNA连接酶 1μl
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