4：RT-PCR反应中模板RNA的最小需要量,与模板RNA和引物片断的类型有关,对于系统提供的对照RNA模板,每一反应所需的最小量为10的3次方分子(2.5Zeptomoles，2.5〓10-25mole)。为了使RT-PCR实验能获得较好的结果,要求,对于总RNA作为模板,这在每一反应中其量应为10pg-1μg,而对于mRNA做模板则要求量为1pg-100ng。
5：在RT-PCR实验中,最好进行对照和空白对照反应,在进行对照反应实验时,反应体系中加入试剂盒提供的对照模板和对照上下游引物；在进行空白对照反应时,则采用灭菌的无DNA水代替RNA作为模板,用于反应体系。在实验中要特别注意防止各次实验之间样品与前次实验的残留核酸(DNA或RNA)的交叉污染。每次实验中扩增前的操作步骤应与扩增后的操作步骤最好有相互分开的工作区和取液器具。操作中最好使用能很好防尘的吸头。操作人员要戴上手套,并经常更换。实验中应用UNG或其他灭活技术处理以防止残留DNA被带入反应过程。
6：镁离子浓度
在RT-PCR反应系统中,由AMV逆转录酶和由TflDNA聚合酶催化的两步反应均需要镁离子,而这两步反应中所需的镁离子量且由反应体系中的核苷酸、寡聚核苷酸引物及模板的终浓度决定。反应体系中硫酸镁的使用浓度必须满足模板/引物的综合需求,虽然1-2.5mM的浓度的硫酸镁能基本满足大多数RT-PCR的要求,但镁离子浓度更进一步精确,将使逆转录和扩增过程灵敏度更高、专一性更强、质量更好。为了正确确定反应中所需镁离子的浓度,在正式实验前应先进行一系列平行实验,在这些平行实验中,在50μl反应液中分别加入
1,2,3,4,5,6μl硫酸镁储液(试剂盒所带,25mM),然后比较各实验结果,以确定镁离子浓度。 7：引物设计
在操作中必须用特殊的引物来进行第一链的合成。这种引物与模板上一特定序列煺火,将模板上的某一段mRNA(而非整个样品mRNA)反转成cDNA。对于cDNA和基因组DNA的扩增差异来讲,前者的引物是与外显子而非内显子互补的。基因组DNA的扩增产物要比RT-PCR的产物大许多,这种长度上的差异不仅有助于在胶上将两者分开,而且更有助于cDNA的扩增产物的形成(因PCR在短片断的合成上更具优越性)。引物浓度是RT-PCR中应考虑的另一个引物方面的问题,我们建议开始时的引物浓度最好用50pmol(这样终浓度可为1μM)。 8：模板 温度及循环数
RT-PCR反应中并不要求模板变形,如操作人员想加这一步,则应经模板/引物混合物与其他反应液分开,单独对模板/引物在94℃变性2分钟(AMV千万不能参与变性,否则将失活),然后再将其加入到RT-PCR的其他反应液中,在48℃保温。在AMV/Tfl反应缓冲液中AMV的最适反应温度为37-48℃,我们建议操作温度最好采用48℃,应在此温度下,能最大程度的防止mRNA 的二级结构的形成,从而合成最为完整的cDNA。反转完成后我们建议在94℃保温2分钟,以打破RNA/ cDNA间的二级结构,并灭活AMV反转酶。有报道AMV必须灭活后才能保
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证Tfl等DNA聚合酶进行片断扩增。引物的序列是PCR扩增中各温度设定时首要考虑的因素。常规的扩增过程为变性(94℃),煺火复性(42-60℃),延伸
(68℃),如引物有高的Tm值,则可提高上述的煺火复性(42-60℃)和延伸(68℃)温度,煺火温度越高,非特异性扩增越少,特异性扩增越多。另外如上游引物的Tm低,则应降低煺火复性温度,使引物与模板能很好的煺火。对于PCR循环数我们建议用40个,如模板RNA为稀有RNA,或量很少,则循环数可相应增加到45-50个循环。
实验十：在MJ Chromo4实时荧光系统通过反转录定量（RT-qPCR）对基因表达进行分析
反转录定量PCR(RT-qPCR)具有很高的灵敏性和非常好的动力学检测范围，为基因表达分析提供了一个基准。应用这一技术可以通过荧光强度变化对PCR反应产物进行实时监测。传统的方法，如溴化乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，测定的都是PCR的终产物，而实时荧光定量技术能够对起始摸板进行定量，与传统方法相比实时荧光定量技术显出了极大的优势。
所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图(如图1)。
图1 实时荧光扩增曲线图
一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（threshold value）（如图2所示）。
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图2. 荧光定量标准曲线
CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（如图3所示）。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图3 阈值线和CT值
对反转录定量PCR而言，就是定义不同处理或者不同组织间某个基因初始转录本的含量，我们可以用含有目标基因和看家基因的质粒做标准品，生成各自的定量标准曲线，再用标准曲线去定量不同样品中的目的基因的表达水平。
定量的试剂包括与DNA双链结合的荧光染料和TaqMan探针、分子信标等特异性的杂交探针。与DNA双链结合SYBR-GreenI(SGⅠ)染料因使用简单而被许多定量实验采用。
SGⅠ是一种特异结合双链DNA的染料，已被证明能灵敏的检测核酸。SGⅠ结合双链DNA后荧光增强1000倍左右，极为适合检测PCR扩增产物。由于SGⅠ能结合于所有双链，因而不能特异性的检测某一特定模板。使用杂交探针要求细心设计引物组，而SGⅠ仅需要两个用于扩增的引物，无需对其进行标记。
DyNAzymesII聚合酶在多种扩增反应中产生了很好的结果。这种由Thermus brockianus中分离出来的聚合酶比Taq酶热稳定性更好，能在广泛的反应条件下保持很好的活性。SGⅠ对DyNAzymesII聚合酶的抑制作用更小。本研究的实时定量PCR结果表明使用
DyNAzymesII聚合酶和SGⅠ能够精确灵敏的检测到λ噬菌体和人类基因组DNA的初始浓度。
材料与方法
材料
1．含有?-actin转录本的RNA样品
CT值
阈值线
2．?-actin荧光检测试剂盒（东胜创新Chromo4装机试剂盒）
2×DyNAmo SGI mix 100μl 5uM ?-actin forward primer 20μl 5uM ?-actin reverse primer 20μl
方法
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Ⅰ定量标准曲线的绘制
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1．将含有?-actin基因的质粒做系列浓度稀释，分别为10、10、10、10、10个拷贝。 2．建立15μl PCR反应体系
2 Χ DyNAmo SGI mix 7.5μl 5uM ?-actin forward primer 1.5μl 5uM ?-actin forward primer 1.5μl ddH2O 3.5μl ?-actin标准质粒 1μl 每个样品做２－３个重复
ⅡSYBR Green I荧光染料用于基因表达表达分析
1． 灭菌的微量离心管中加入2ng RNA作为模板，在75°C加热5分钟，迅速置于冰上冷却。 2．每一反应的反应组分如下
MgCl2, 25mM* 4μl Reverse Transcription 10X Buffer 2μl dNTP Mixture, 10mM 2μl Recombinant RNasin? Ribonuclease Inhibitor 0.5μl AMV Reverse Transcriptase (High Conc.) 15u Oligo(dT)15 Primer OR Random Primers 0.5μg RNA模板 2ng Nuclease-Free Water to a final volume of 20μl
在42°C下 孵育15分钟-60分钟。
3.上述反应液在95°C 变性5分钟，然后在冰上迅速冷却。
4. 建立15μl PCR反应体系
first-strand cDNA reaction 1μl 2 Χ DyNAmo SGI mix 7.5μl 5uM ?-actin forward primer 1.5μl 5uM ?-actin forward primer 1.5μl ddH2O 3.5μl Nuclease-Free Water to a final volume of 15μl
Ⅲ PCR反应
1．打开Chromo4定量PCR仪
2. 将反应管置于循环仪中，进行板设置 3．如下设置程序：
step 1 94 ℃, 2min step ２ 96 ℃, 10sec step ３ 63 ℃, 15sec step ４ 72 ℃, 20sec step 5 plate read step 6 84 ℃, 1sec step ７ plate read
step 8 Goto step 2, 39 more times
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step 9 72 ℃, 10min
step 10． Melting curve analysis: 65 ℃-95 ℃, 0.2 ℃ /read , 1 sec hold step 11． 10℃, forever step 12 开始运行
结果分析
1 绘制熔解曲线
随着温度的升高与双链接连结合的SGⅠ释放，荧光信号也随之平滑的下降。荧光强度随温度变化的负一次倒数也被显示。荧光强度变化的拐点（熔点，Tm）处清晰地看到了一个单一的峰。这个峰对应着扩增产物的熔解温度，表明特异扩增了β-actin。荧光强度随温度变化的负一次倒数图中如没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现污染、引物二聚体和假阳性现象。 2 绘制标准曲线
C(t)值（荧光曲线与域值线交叉的点）随着初始模板浓度的增加而成比例的减少，这是因为初始模板浓度高的样品更快的生成足以被SGⅠ检测到的数量的扩增产物。?-actin基因的标准质粒拷贝数与对应的C(t)值成正比，具有极好的线形关系。 3 未知样品中?-actin基因转录本的定量分析
对照标准曲线，依照初始模板量与C(t)的线性关系，可轻松对?-actin基因转录本进行定量。计算每ng总RNA中?-actin的拷贝数。
讨论
实时定量PCR实验设计和数据分析可以采用相对定量和绝对定量两种方法，本实验中所做的是对一个样品中基因表达的绝对定量。研究人员在设计实时定量PCR实验分析基因表达的时候首先要问的一个问题就是：数据最后会以一个什么样的形式得到。如果需要知道绝对的拷贝数，就必须用绝对定量的方法，否则只需要给出基因表达相对量就足够了。相对定量可能比绝对定量要更容易一些，因为它不需要作标准曲线。
本文所给出的公式对于每个用相对定量的方法分析基因表达差异的研究人员都足够了。下面，我们总结一下实验设计和评估中的一些重要步骤： （i） 选择一个内标基因。 （ii） 确定内标的有效性，确保它不会受到实验处理的影响。
（iii） 通过PCR扩增目标基因和内标基因RNA或cDNA的一系列梯度稀释模板确保它们
的扩增效率相同。 -△CT
最后通过2计算将统计数据转化成线性形式而不是原始CT值。
第四部分：文库构建技术 实验十一.：mRNA的提取及纯化 真核细胞的mRAN是单顺反子，其最显著的特征是具有５'端帽子结构和3'端的poly A的结构，此poly A结构为mRNA的提取提供了有效的途径，人们利用碱基配对原理，采用寡聚Ｔ结构作为亲和柱材料，当含mRNA的总RNA样品流经寡聚Ｔ柱时，mRAN即被特异性的结合到柱上，从而可与其它RNA相分开，这就是寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲和柱分离mRAN的原理。目前虽然mRNA的提取已有多种方法，如超速离心法、免疫法，但较常用的、简便的方法还应是柱层析法。不过近几年,mRNA的提取方法又有所改进和突
破,mRNA的磁珠分离即是这些新方法中的一类主要技术。该技术建立于３类强有力的相互作用上，即A与T碱基间的强配对性；链菌素抗生物素与生物素间
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