操作，使学员掌握这一DNA片段的连接操作技术。 A：溶液中连接 一：仪器 离心机、恒温设备、真空干燥机、取液器 二：试剂 T4DNA联接酶
10〓T4DNA联接酶缓冲液
200mM Tris-HCL (pH 7.6)、50mM MgCL2、5mM ATP、50mM DTT 500μg/ml ／牛血清白蛋白(可不用)
λDNA/HindIII 酚/氯仿、 酚、氯仿、TE缓冲液、电泳缓冲液、3M NaAC(pH 5.2)
三:操作： 1:取干净、灭菌Ephondof管，安下表加入各试液 T4DNA联接酶缓冲液 1ul 载体DNA片断 1ng 插入目的片断 Xng
连接酶 1u(平末端,如为粘端连接,则酶量可小于1u) 加无菌水到 10ul
X=目的片断与载体片断的分子比例〓载体ng数〓目的片断的碱基数/载体ng数
（目的片断/载体片断的分子比例一般为3/1） 2:连接反应
22℃保温3小时或4℃过夜(Promega连接酶,粘端连接) 或22-26℃1hr(BRL连接酶,粘端连接) 或22℃4-16hr(Promega连接酶,平端连接) 或14℃16-24hr(BRL连接酶)
B：胶内连接：该方法是一种快速克隆技术，将要重组连接的外源DNA片断用低熔点琼脂糖分离，在紫外灯下切下待克隆片断，溶化后加入缓冲液、载体DNA、连接酶直接连接。这种连接的待克隆片断既可以为酶切基因组片断也可为PCR片断，既可平连也可粘连，但连接效率较溶液中连接要低的多，但这种连接省去了待克隆片断的回收纯化操作。这种连接方法要求目的DNA量、载体量及酶量都要增加。 一：仪器：同A 二：试剂：同A 三：操作 1：低熔点琼脂糖胶分离外源DNA片断，在紫外灯下切下目的片断
2：65℃保温彻底溶化琼脂，取18ul（约0.1-0.5ug）于一新管内再加入2ul载体（约0.01-0.05ug）混匀，37℃5－10min
3：配制2〓T4DNA连接酶反应体系20ul，（其中含2〓T4DNA连接酶缓冲液和不低于2uT4DNA连接酶）混匀，点动离心后臵于冰浴
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4：将预冷的2〓T4DNA联接酶反应体系20ul加到“2”中含待连接DNA样品管中立即混匀后立即臵于冰浴中待凝固 5：臵于12℃连接过夜。
6：此连接片断可直接用于转化，即转化前65℃溶化，取5－10ul转化。 注1：粘端连接时模板DNA用量控制在0.1-0.5ug间，而平连时模板量应>0.5ug。拈连时温度可在4℃过夜，而平连时最好在12－16℃过夜 2：用于转化的连接片断最好不要冰冻
3：胶内连接时，应用TAE缓冲液，而不应用含TBE的胶，因硼酸能与琼脂糖中的方式糖单体或多聚体结合成难溶复合物，这种复合物使胶难熔解，将抑制连接酶。
4：在紫外光下观察切割条带时,操作要快，DNA条带在紫外光下的暴露时间应尽量短，因UV会引起DNA变异。
实验七: DNA片断的回收技术 目的DNA片段的回收技术是重组DNA中的关键技术，回收是指从电泳介质中纯化出目的片断。目前待回收的片断主要有酶切片断和各种PCR片断；回收的介质主要有琼脂糖和PAGE；回收的方法主要有树脂回收、微量柱回收、玻璃奶回收、液氮冻冻融回收及透析袋大量回收等，下面分别介绍树脂、微量柱及液氮冻冻融回收技术。
方法一：树脂回收技术 本方法特别适合于PCR片段的回收，具有纯度高、操作简洁等特点，经此方法回收的片段可有效的用于重组载体构建。通过15分钟的纯化过程,PCR产物即能被有效地从含引物二聚体、非特异性扩增引物片断等混合物中分离出来，成为高度无盐的、不含其他大分子成分的纯化片断。在较宽的分子量范围内有较高的回收效率。下表为不同长度的DNA片断,在室温条件下,用此纯化系统直接纯化时,各自相应的回收率。 dsDNA长度 bp 200 1500 300 200 75 50 回收率% ≥ 60 96 99 69 3 2 一：仪器 离心机 电泳议 电泳槽 取液器 微量真空装臵 抽滤装臵 二：PCR片断纯化试剂盒 80％异丙醇 三：操作
（一）从琼脂糖介质中纯化DNA片断
1:用低熔点或常规熔点琼脂糖电泳对PCR扩增片断进行分离,该电泳安常规方法进行,缓冲液为TAE.
2:在凝胶上,找到所需条带,然后用洁净并灭菌的小刀将其切下接近300微升琼脂糖凝胶 (约300毫克)
3:如果切下的琼脂糖为高融点的则安下面A步骤进行,如为低融点琼脂,则安B步骤进行。
A：将300微升琼脂块放进1.5毫升的微量离心管中,加入1毫升纯化用树脂,
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然后将其臵于65℃水浴保温5分钟,或保温至琼脂完全溶解。
B： 将300微升琼脂块放进1.5毫升的微量离心管中,然后将其臵于70℃水浴保温至琼脂完全溶解,然后加入1毫升纯化用树脂到融化好的琼脂中,将其混合20秒,但不要振动。
4:为每一个待回收片断准备好一个微量柱. 在每个柱的开口处,联上一针筒,然后将这些柱与针筒的复合体与抽真空设备相连
5:在柱-针筒复合体中加入树脂/DNA混合物,打开真空装臵,将树脂与DNA的混合物抽到 微量柱中,断开真空装臵与柱的连接。
6:洗柱,加入2毫升80%的异丙醇,打开真空装臵,使这些洗柱液完全流经微量柱。
7:继续真空30秒以干燥树脂,注意此干燥时间不能超过30秒。关闭真空,移去针筒。将微量柱转移至一1.5毫升微量离心管中。10000g离心2分钟,以彻底除去残存的异丙醇。
8: 将微量柱,再转移至一新的1.5毫升微量离心管中,加入50微升水或TE缓冲液,静臵1分钟(在头30秒,DNA仍将吸附于柱上), 10000g离心20秒,以洗脱DNA片断，所得纯化后的DNA片断可直接用于连接反应或在-20℃保存。 注：1对于>3Kb的片断在纯化回收时,洗脱前,如先将水或TE缓冲液预热到65-80℃,则将能有效的提高回收率。待洗脱片断>3Kb时,洗脱液温度应为65-80℃;待洗脱片断>20Kb时,洗脱液温度应达80℃。
2应用TAE缓冲液，而不应用含TBE的胶，因硼酸能与琼脂糖中的方式糖单体或多聚体结合成难溶复合物，这种复合物使胶难熔解。
3：在取用纯化柱树脂中的液体前,应将树脂充分搅匀,如树脂中出现结晶或结块,则应将树脂在25-37℃,温热10分钟,冷却至30℃使用。树脂本身不会溶。 4：在紫外光下观察切割条带时,操作要快，DNA条带在紫外光下的暴露时间应尽量短，因UV会引起DNA变异。
PCR回收示意图
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（二）尿素丙烯酰胺变性胶中分离DNA片断
1:从变形胶上切下待回收片断,将其放如一微量离心管中。 2:加入100微升TE缓冲液,37℃保温30分钟以上。
3:将上清液吸入一新管中,加入1毫升树脂,振荡20秒以混匀树脂与清液 4－8:同（一）中“4－8”。
方法二：微量柱法纯化DNA片段
本方法具有操作简单的特点，特别适合于PCR片段、酶切片段等的回收 一：仪器：同方法一
二：试剂：微量柱、其它试剂同方法一 三：操作：
1：紫外灯下从胶上切下目的片段，放入一Epphendof管中 2：离心管在－20℃冷却5－10分钟
3：将微量柱下套上一Epphendof管，将冷却的胶条装进微量柱中，4℃ 12000rpm离心10分钟
4：弃微量柱，用酚/氯仿、氯仿抽提Epphendof管中液体各一次 5：1/10体积乙酸钠＋2体积无水乙醇沉淀2小时 6：70％乙醇洗沉淀，真空干燥，复溶于dd水或TE中 方法三：液氮冻融法 一：仪器 同方法一
二：试剂：液氮，其余同方法一 三：操作：
1：紫外灯下从胶上切下目的片段，放入一Epphendof管中
2：离心1min，加入500ulTE，200ul酚/氯仿混匀
3：离心管放入液氮中10－15min，再室温放臵，反复冻融 4：用酚/氯仿、氯仿抽提Epphendof管中液体各一次 5：1/10体积乙酸钠＋2体积无水乙醇沉淀2小时 6：70％乙醇洗沉淀，真空干燥，复溶于dd水或TE中 方法四：从变性PAGE中纯化DNA片断的常规方法 一：仪器：同方法一
二：试剂：PAGE电泳试剂 TE 无水乙醇 70％乙醇
洗脱缓冲液I（10mM Tris-HCL pH 8.0 0.1Mm EDTA pH 8.0）
洗脱缓冲液II（0.5MNH4AC 10mM Tris-HCL pH 8.0 0.1Mm EDTA pH 8.0） 三：操作：
1：PAGE电泳，如EB染色的则在紫外灯下切下目的片断，如龈染或其他非放染色的则在关下切下目的片断
2：用少量脱缓冲液I将目的片断胶条洗至一Eppendorf管中，用玻棒将凝胶捣碎，用150ul洗脱缓冲液II将玻棒上的凝胶洗至Eppendorf管中 3：振荡后臵于37℃3－5小时或过夜
4：振荡后离心（10000g10min），取上清液，并再用200ul洗脱缓冲液II洗
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涤旧管，离心再取上清液
5：合并两次上清液，乙醇＋醋酸钠沉淀同前。
第三部分：PCR技术
实验八:PCR扩增产物的克隆技术
利用各种PCR技术扩增特异DNA是获得目的基因和特异探针的一种最有效、最简便的方法。但PCR扩增出的片断如不经进一步克窿是无法变成可利用基因，因此PCR扩增产物的克窿技术是DNA重组技术中的一个最重要部分，该技术是目前分子生物学实验中最重点内容，要综合前面实验中所介绍的各种技术，起着承上启下的作用。PCR产物的克隆一般要经过PCR产物的纯化、产物与载体的酶切、脱磷及连接、转化、筛选等几个步骤实现。PCR产物与载体的连接方式有实验八中提到的溶液连接和胶内连接，可粘连、平连、粘平连及与T－载体的单位点配对连接（见图9－1）。
PCR产物 PCR产物 PCR产物 PCR产物 PCR产物 （上下游引物中各带 （上下游引物中仅有 （上下游引物 （PCR产物与载体 一种特异酶切位点） 一种特异酶切位点） 中无酶切位点） 均有两个酶切位点 但只有一个是相同的） PCR产物 纯化回收
PCR产物及载体 PCR产物单酶切 PCR产物Klenow酶补平 PCR产物与载体 T－载体 双酶切，载体脱磷 载体双酶切、脱磷 载体用平末端酶切割 双酶切载体脱磷 单碱基
粘连 粘连, Klenow酶补平 载体脱磷后平连 粘连 Klenow补平 粘连
后平连 或加接头粘连酶补平 平连
八－1：PCR产物克窿方式示意
粘连时载体与外源DNA的比例1：3比较合适，而平连时可达到1：10
在这些方法中，T－载体技术比较简便有效的，尤其对于一些多克隆位点的可选择内切酶种类稀少的表达载体该技术特别适用。该方法具有不需对引物进行特殊酶切位点的修饰，即能直接进行PCR产物的克隆，并具有克隆效率高的特点。通用载体的T-载体有商品出售，一些特殊载体的T－载体可自己制备。T-载体均是通过载体是通过用EcoRⅤ或SmaI等平末端酶将相关载体切割出平端,然后再在其两个3`端加上T而构成的。这些存在于插入位点的突出的3`末端可防止载体的自身环化,并为PCR产物提供碱基配对区（因PCR扩增产物的3`末端为非特异性的A碱基）而有效地提高了PCR扩增片断的克隆效率。
本实验中用pGEMR-T载体为材料，来让学员学习T－载体克窿技术。PGEM－T载体来自于PGEM系统载体，这类载体中中含有T7和SP6RNA聚合酶的启动子系列,该系列侧翼为一多克隆位点区,该区有β-半乳糖苷酶的α-肽端的编码区。β-半乳糖苷酶的α-肽编码区的插入失活,能使重组子在指示平板上通过颜色反应加以检测。此两个载体的多克隆位点区含有多种内切酶位点,此很容易来构建嵌套缺失位点。pGEMR-T Easy载体系统的多克隆位点两侧都存在
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